氦气腹是否能减少脓毒症动物在腹腔镜检查时的高炎症反应?

抽象的

背景/目的。腹膜感染和伴随手术的加重反应的特征是强烈的高炎症状态，其程度与组织损伤的严重程度成正比。与开放式手术相比，腹腔镜手术产生较低水平的组织损伤，应较少引起明显的免疫反应。本研究的目的是确定腹腔镜辅助氦气而不是二氧化碳气腹是否会诱导脓毒症动物的炎症减弱状态。材料和方法。将32只Wistar大鼠随机分为4组，每组2只，采用二氧化碳或氦气腹腔辅助腹腔镜盲肠结扎穿刺(CLP)诱导脓毒症并灌洗腹腔。两个对照组接受相同的腹腔镜手术，使用二氧化碳或氦气作为注入气体，但不使用CLP。24小时后，血清肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1和6(分别为IL-1和IL-6)和皮质醇。结果。在接受二氧化碳或氦气腹腔腹腔镜检查的脓毒症动物组中，I - L-1和IL-6的平均浓度没有显著差异，但显著高于各自的非clp对照组。相反，TNF-的水平α两组化脓性动物中的皮质醇是相似的，但与各自的非CLP对照没有显着差异。结论。由于促炎TNF-的水平，腹腔注射氦气与二氧化碳在炎症反应方面相似α，IL-1和IL-6和抗炎皮质醇对两种气体相当。

1.介绍

腹膜炎是异构疾病的最终表达，其各种严重程度通常发生在外科实践中。弥漫性粪便腹膜炎是最严重的感染形式，迅速促进腹部败血症，如果留下未经处理的话，发育成脓毒症休克，多器官衰竭和死亡[1］．

腹膜感染引起的炎症反应在患者中产生生理和免疫改变，这是神经内分泌系统、代谢系统和免疫系统之间复杂的相互作用造成的[2那3.］．此外，手术切口、组织剥离、脏器和血管操作、血管内皮暴露等引起的组织损伤与全身炎症反应密切相关[4.］．对感染和任何伴随治疗的一种加剧反应的特征在于强烈的促炎阶段，并且这种高炎症状态对个体是有害的，因为矛盾的是，它导致免疫抑制作用[5.]，其幅度与组织损伤的严重程度成比例[6.］．由此产生的免疫损害会引起各种术后临床并发症，这些并发症可能是致命的[7.］．

与开放手术相比，腹腔镜手术造成的组织损伤程度较低，理论上应引起不那么明显的免疫反应[7.］．在此基础上，腹腔镜在涉及腹部脓毒症患者的复杂手术中的应用越来越多[8.］．这种手术需要通过向腹腔内注入气体(如空气、二氧化碳、一氧化二氮或氦)来形成气腹[9.］．

目前，二氧化碳肺胆碱最常用于涉及没有患者或败血症的患者的选修和应急手术中使用。一些研究人员据报道，二氧化碳肺胆管内含有诱导细菌腹膜炎的实验动物的死亡率[10.-12.]，表明二氧化碳对加剧炎症反应的保护作用。另一方面，Chekan等人。[13.]观察到二氧化碳肺肺嘧啶在感染的小鼠中降低了腹膜内免疫反应李斯特菌与氦气吹塑相比，从而增加了控制传染病的扩散的难度。众所周知，二氧化碳的存在减少了促炎细胞因子的生产，例如肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1和6（分别），表明气体暂时通过可能与局部或全身pH的减少相关的机制抑制巨噬细胞活性[14.-18.］．根据Hanly等人。[19.[通过涉及腹膜细胞酸化的机制，在腹腔镜手术期间衰减由二氧化碳肺肺膜介导的炎症反应的衰减。

尽管如此，尚未明确建立腹壁升降机（有或没有低压气膜磁体）或替代吹入气体的应用的标准压力二氧化碳肺肺肺肺肺气球的优点，特别是关于局部和全身免疫反应的应用[7.］．在二氧化碳抑制炎症反应已被证明对个体免疫功能有害的情况下[13.]，一种惰性气体，如氦气，可用作替代充气器[20.］．一些研究人员[10.那18.那21.]据说，与氦的二氧化碳相比是有利的，与在微创手术中的肺炎骨酮中的氦气中的氦气相比，因为它在限制炎症反应并保持个体的免疫状态方面更有效。然而，Sietses等人。[21.结果显示，在二氧化碳或氦气气腹的选择性胆囊切除术患者中，促炎细胞因子如IL-6的水平相似。此外，Jacobi等人[15.结果表明，在大鼠腹膜炎模型中，氦气比二氧化碳更能降低菌血症的发生率，并减少全身炎症。

考虑到腹部脓毒症的病理生理学和治疗结果仍然尚不清楚，我们假设氦气肺卟啉酮患者减少了腹腔镜治疗的大鼠的腹腔镜治疗大鼠对腹腔镜诱导的败血症的高血压反应。本研究的目标是将大鼠的全身免疫反应进行比较，并通过腹腔镜用二氧化碳或氦作为腹菌剂进行处理，并确定败血症生物标志物的水平，即皮质醇，IL-1，IL-6和tnf-α，在提交给不同治疗的大鼠组中。我们的结果提高了我们对肺胆管内采用不同气体的影响的理解。

2。材料和方法

该研究得到了Federal De Minas Gerais的媒体动物伦理委员会批准（2015年12月9日;议定书号417/2015）并根据全国动物实验委员会颁发的动物颁发的动物的人道主义使用指导方针进行。

2.1。动物和实验设计

该实验是随机设计，涉及由媒体联邦·米纳斯·米达斯的媒体动物屋提供的三十两周雄性Wistar大鼠。在12小时的光周期制度下，将动物保持在标准的木制笼子中并提供随意随着商业啮齿动物的食物和水。将动物随机分布成四个大鼠的4个实验组。两组被提交给盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的败血症和随后的腹部灌溉，涉及腹腔镜手术，其中二氧化碳或氦气肺卟啉（分别分别组SLC和SLH）。将两组对照组提交以具有二氧化碳或氦气孔（分别分别的氦气肺吡啶（CLC和ClH）的相同腹腔镜程序，但没有CLP。对于SLC，SLH，CLC和CLH组，动物的平均重量（G±标准误差）分别为303.50±29.97,233.88±63.33,249.13±21.72和304.63±32.31g。

２.２.外科手术

在手术前，所有动物都接受了单一肌肉内剂量（30mg / kg）的抗生素头孢菌（rocephin; Roche，Rio de Janeiro，RJ，巴西），随后通过肌肉注射氯胺酮的混合物（40毫克）麻醉/ kg;CristáliaproputosQuímicosefarmacêuticos，Itapira，sp，巴西）和木嗪（8 mg / kg; schering-plow，cotia，sp，巴西）。将SLC和SLH组中的动物提交给腹腔镜检查，与二氧化碳或氦气相当，适当的，为了暴露盲肠，并允许CLP根据标准技术进行（图1）[22.］．组中的动物CLC和CLH被提交到相同的程序，但没有进行CLP。手术开始两小时后，所有群体的动物都经过腹腔镜检查腹腔检查，涉及A15分钟与二氧化碳或氦气的吹气。在此过程中，动物接受了两种腹部灌溉，其中5mL预先温热至37℃的5ml 0.9％盐水溶液，吸出过量的液体。术后施用单一剂量的布洛芬（10mg / kg）给所有实验动物施用。在手术后24小时，通过穿刺下腔静脉从每只动物收集2ml外周血样品，并在没有抗凝血剂的情况下转移到小瓶中。将血液样品以2500rpm离心10分钟，然后将血清分离并在-80℃下储存在冷冻机中，以便随后评估促炎生物标志物和皮质醇的水平。然后用过量的氯胺酮（120mg / kg）对所有实验动物进行安乐死。

２.３.免疫测定

使用荧光偏振免疫分析(FPIA)试剂盒测定皮质醇，使用Quantikine™大鼠IL-1测定IL-1β套件（研发系统，Thermo Fisher Scientific，Minneapolis，Mn，USA）和IL-6和TNF-α采用LEGEND MAX™大鼠IL-6和TNF-αELISA试剂盒(BioLegend, San Diego, CA, USA)血清标本在室温下解冻，等量(50μL)与50孔微孔板一起转移到96孔微孔板上μL磷酸缓冲液和18μ根据试剂盒供应商的指示，确定适当的试剂。室温孵育2 h, 500洗涤μL缓冲液，2500 rpm离心10分钟。取各孔上清液，用200稀释μ然后用ASYS Expert Plus分光光度计(Biochrom, Cambridge, UK)测定450 nm和550 nm处的吸光度差异。

2.4。统计分析

Statistical analyses were performed using IBM® SPSS® Statistics 19 software 1989. Data were submitted to the Kolmogorov–Smirnov test for normality and variables with normal distributions were compared using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni’s multiple comparison test or pairwise Student’sT.-测试。使用多元kruskal-wallis测试或Mann-Whitney进行比较呈现非正规分布的变量你比较两个样本平均值的检验。组间差异被认为有统计学意义 。

结果

CLP和腹腔镜检查后24小时进行的检测显示，抗炎皮质醇和促炎细胞因子TNF-的平均水平α在SLC和SLH动物中差异无统计学意义( ）分别由CLC和CLH控制(表1）。此外，SLC和SLH组动物中皮质醇的水平类似，与TNF的动物一样α。

另一方面，SLC和SLH动物中IL-1的平均浓度显着高（和0.0001分别比各自的对照，尽管SLC和SLH组的动物之间的差异不显着（ ）。同样，SLC和SLH动物的IL-6平均浓度显著升高(和0.009)，但差异无统计学意义( ）这两组细胞因子的水平

4.讨论

在本研究中，我们评估了TNF-的水平α在腹腔脓毒症小鼠模型中，IL-1、IL-6和皮质醇的水平显示，在腹腔镜手术后24小时，脓毒症动物的促炎白细胞介素水平显著高于它们的非clp对照组。这些细胞因子的升高与急性病情的发展是一致的，并且与腹腔镜手术中使用的注射器类型无关。有趣的是，TNF-水平没有显著变化α和CLP组的皮质醇与各自的非CLP控制相比。

急性腹膜炎与高率的发病率和死亡率相关，并仔细控制感染源的源于成功治疗的关键[8.那23.］．微创手术技术的使用，特别是经皮液体引流和腹腔镜，在复杂的腹部感染的患者边缘的生理状况，如糖尿病、肥胖、高龄和免疫抑制，腹腔镜手术的负面影响，虽然是控制感染的基础，但可能会超过益处[23.］．虽然在大多数情况下经皮排水是可行的，但一些复杂的情况，例如循环，瘘管和缺血地区之间的未放弃解剖部位或脓肿，需要切除和导管引流是不实际的[23.］．由于这些原因，腹腔镜手术在外科医生中越来越受欢迎，因为它可以为腹部脓毒症患者进行困难的手术[8.］．

知识人体反应，特别是免疫应答，微创手术是重要的，因为它为医生提供了关于使用小说方法或接入路线治疗其患者的风险和益处的决策的基础。腹部败血症领域的台式转化药物目前是相当大的兴趣，并且需要调查该综合征的演变中的具体方面和干预因素，鼓励寻找繁殖人类免疫系统行为的动物模型。已经使用几种方法在动物模型中诱导腹膜炎，包括腹腔沉积粪便，接种特定菌株和微生物量，并打开肠道并建立连续性的路径以提供内源性粪便污染来源[24.］．后一种模型包括在本研究中使用的CLP技术，因为它被认为是评估败血症情况下免疫应答的标准方法及其与侵入手术的相关性[25.］．实验模型的选择对于研究的临床应用是重要的，因为它受到兴趣变量的影响，并影响所获得的整体结果。

脓毒症临床表现的严重程度不仅取决于所涉病原体的毒力，还取决于在疾病发展过程中宿主产生的免疫功能障碍的程度[5.那25.］．细胞因子,特别是TNF -αIL-1是免疫应答的重要调节因子，其在脓毒症中的病理生理作用已被广泛研究[26.］．释放tnf-α从巨噬细胞开始在煽动事件后30分钟内开始，而IL-1以类似的时间框架释放，主要来自活性巨噬细胞。虽然这两种细胞因子作用于不同的靶细胞（巨噬细胞，内皮细胞和中性粒细胞），但通过激活免疫细胞分泌诸如促炎细胞因子，炎症的脂质介质和反应性氧气和氮气物种的免疫细胞阵列，均可扩增炎症级联。。以这种方式，tnf-αIL-1协同作用诱导一种以血管通透性、严重肺水肿、出血和发热为特征的休克样状态。

促炎细胞因子IL-6由各种细胞产生，包括巨噬细胞，树突细胞，淋巴细胞，内皮细胞，成纤维细胞和平滑肌细胞，响应于脂多糖，IL-1和TNF-的刺激α。IL-6的浓度在诸如手术应力，创伤，多器官衰竭和TNF之后的脓毒症休克和峰值的条件下升高α和il - 1。事实上，血浆IL-6水平被认为是疾病严重程度的可靠指标。然而，尽管IL-6具有促炎特性，但它也被证明通过抑制TNF-的释放来促进抗炎反应α和IL-1增强抗炎介质的水平，包括IL-10，转化生长因子β（TGF-β）和糖皮质激素皮质皮质醇[26.］．

通过涉及揭开丘脑 - 垂体 - 肾上腺（HPA）轴的激活的级联来控制皮质醇的浓度，从下丘脑开始释放Corticotropin释放激素（CRH）。这种激素促进了垂体腺体中的肾上腺皮质激素（ACTH）的生产，垂直腺体又刺激了皮质醇的合成。在败血症的急性期，上调皮质醇的全身浓度，已经表明，化粪池过程的前24小时内皮质醇水平是用于死亡率的良好预后标志物[27.］．全身性皮质醇水平的这种增加的机制并不完全清楚，但被认为是通过抑制皮质醇对HPA轴的负反馈作用来直接诱导CRH和ACTH或间接诱导。此外，一些研究表明TNF-的刺激效果αHPA轴上的IL-1和IL-6 [28.那29.］．

最近关于败血症病理生理机制的研究表明，促炎细胞因子的加剧释放（所谓的“细胞因子风暴”），如TNF-α，IL-1和IL-6，由某些抗炎细胞因子抵消，包括IL-10，转化生长因子（TGF） -β和IL-4，试图恢复免疫稳定性[26.］．邓等。[5.]采用CLP小鼠模型，然后静脉注射假单胞菌铜绿假单胞菌研究表明，手术后细胞因子水平显著升高，在12小时达到峰值，但在24小时后促炎和抗炎细胞因子水平下降，而细菌负荷仍然很高。这些作者得出结论，CLP手术后的第一天是过度炎症向免疫抑制的转折点。

虽然二氧化碳是腹腔镜手术中最常使用的气体[9.，它作为一种注气器的优点受到了挑战。有人认为，二氧化碳注入通过一种涉及腹腔酸化和炎症细胞因子IL-1和TNF-可逆抑制的机制，有助于减弱免疫反应α[14.那18.］．在这种情况下，Hanly等人。[10.]报道，二氧化碳肺肺吡啶蛋白增加​​了血浆IL-10×35％，减少了TNF-α与氦肺肺术相比，暗示通过IL-10介导的TNF的下调减少死亡率 -α。其他研究表明，二氧化碳吹入量增加存活率并阻止鼠模型中的死亡率与诱导腹膜炎[10.那11.甚至可以显示保护作用[12.］．然而，一些研究人员已经证明，氦气注入在保持免疫反应方面比二氧化碳更好[13.]降低菌血症和局部和全身炎症[15.］．影响局部和全身炎症的其他变量是所使用的气体压力和腹腔镜检查的持续时间。Schietroma等。[30.]显示，在CO压力降低的腹腔镜肾上腺切除术中，炎症标志物(中性粒细胞弹性蛋白酶、IL-6和IL-1以及c反应蛋白)水平显著降低₂在术后24小时内进行评估。

在本研究中获得的结果表明，无论在胰岛素的肺胆管内都使用二氧化碳或氦气，鼠模型中对腹脓毒症的炎症反应是相似的。α，IL-1和IL-6和抗炎皮质醇对两种气体相当。选择最合适的气体气体留在医生手中，因为它取决于各种因素，包括麻醉类型，生理相容性，毒性，易用性，安全性，递送方法和成本。

我们的研究仅限于某种程度上通过使用的小样本尺寸，并且评估了生物标志物的短期（24小时）。特别是意外发现tnf-α而皮质醇水平在24小时内没有上升，这可以归因于所采用的检测方法的检测限度，因此细微的变化仍然无法检测到。我们工作的优势在于采取了适当的控制措施。进一步的研究应该解决这些局限性，并关注于氦气和二氧化碳气腹与其他变量之间的相互作用。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中（表格1）。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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