儿童牙龈和牙滤泡干度及基因表达的比较

摘要

本研究的目的是根据人类牙龈和牙滤泡(DFs)的生物学特性，比较其差异基因表达和干度。齿龈()及DFs (）从18名儿童收集。使用cDNA微阵列收集比较基因表达谱。通过定量逆转录 - 聚合酶链反应（QRT-PCR）评估显影，趋化性，间充质干细胞（MSCs）和诱导多能干细胞（IPS）相关基因的表达。使用苏木精 - 曙红和免疫组织化学染色进行组织学分析。Gingiva对与角蛋白化，外胚层发育和趋化性相关的基因表达，而DFS表现出与牙齿和胚胎发育有关的基因的更高表达水平。QRT-PCR分析表明，IPSC因素的表达水平包括SOX2.，KLF4，和c-myc.是，，和在牙龈和VCAM1（CD146）和阿尔卡姆（CD166）是和DFS中的时间更高。与MSCS标记相关的基因，包括CD13，CD34，CD73，CD90，和CD105.在DFs中表达水平较高。qRT-PCR和IHC染色结果支持芯片分析结果。有趣的是，这项研究表明iPS细胞的转录因子在牙龈中表达水平较高。鉴于最小的外科不适和简单的可及性，牙龈是一个很好的候选干细胞来源在再生牙科。

1.介绍

使用间充质干细胞（MSCs）的组织工程是最有前途的治疗策略之一，因为MSCs具有高增殖潜力，并且可以被操纵以允许移植前的分化[1，2］．迄今为止，已从牙科纸浆干细胞（DPSC）中分离出不同的人体牙菌干细胞[3.]，来自剥落落叶齿的干细胞（棚）[4]，牙周韧带（PDL）干细胞[5]、根尖乳头干细胞(SCAP) [6和牙滤泡前体细胞(DFPCs) [7］．近年来，越来越多的证据表明，牙龈源性间充质干细胞被分离出来，并具有多系分化能力和免疫调节特性[8］．最近揭示了牙卵泡和牙龈中的干细胞群的存在，相关基因表达模式仍不清楚。

牙科卵泡（DF）组织是搪瓷器官的结缔纤维组织囊和发展牙胚的牙科乳头[9］．已经提出了DF细胞的能力分化为由豆类，肺泡骨和PDL组成的牙周炎[10.，11.］．尽管存在与DFS类似的外胚层来源，但牙龈似乎在维持组织完整性和炎症反应期间表现出不同的功能活性[12.］．它具有一种独特的无瘢痕愈合过程，而不是经常在受损的口腔外组织中观察到的瘢痕形成。因此，牙龈组织具有加速伤口愈合的独特特征，表明其具有独特的干性，具有诱导定向分化和再生的能力。

虽然进行了一些努力以识别跨期差异表达的基因[12.- - - - - -14.]，牙龈和DFs之间的基因差异尚不清楚。鉴于这两种组织在解剖学和功能上的差异，我们有理由认为基因表达模式也存在差异。因此，研究牙龈和牙滤泡间质-上皮细胞相互作用的遗传机制，对牙周组织再生过程中细胞数量和信号系统的调控具有重要意义。本研究的目的是比较牙龈和DFs的基因表达模式，以提高我们对牙龈的独特再生能力和组织分化能力的认识。

2.材料和方法

Yonsei大学牙科医院的机构审查委员会批准了实验协议（批准编号2-2015-0005）。所有科目或其监护人都提供了书面知情同意书。我们使用类似于最近歌曲等人的程序。[15.]和lee等人。[14.］．

２.１.组织取样和RNA分离

从儿童()(男5名，女4名，年龄7至12岁)，有健康牙龈，曾因拔除多生牙、患牙瘤或因正畸原因行牙龈切除手术。DF组织取自儿童(）（6名男性和3岁的女性，6-8岁），它们在初始牙齿的提取过程中与牙齿的冠状部分分开。在DF中，提取插座周围的一条牙龈组织被小心地刮伤。立即冷冻这些样品并储存在液氮中。我们使用新鲜组织而不是培养的细胞，因为在组织水平，基因表达反映了许多基因的同时谱，并且可以进入由基因组组的协调作用介导的生理过程或组织特异性功能的额外见解。Gingiva和DFS立即浸没在RLT缓冲液中，这是RNEASY纤维迷你KIT®（QIAGEN，CA，USA）的组成部分。在RNA提取之前，RLT缓冲液中的组织使用BulletBlender®珠（Next Advanced，Inc.，Ny，USA）均质化。根据制造商的说明，使用Rneasy纤维迷你试剂盒（QIAGENGEN，USA）从Gingiva和DFS中提取总RNA。提取的RNA在25中洗脱 μ.无菌水的L。使用分光光度计(NanoDrop ND-2000, Thermo Scientific, IL, USA)从260 nm波长处的吸光度值测定RNA浓度。本研究中使用的RNA样本的260/280比率至少为1.8。

２.２.cDNA微阵列的构建与数据分析

使用Affymetrix GeneChip®人类基因1.0 st寡核苷酸阵列进行全局基因表达分析（Affymetrix Inc.，USA）。从牙龈和DFS分离的平均RNA的量为1 μ.g.按照制造商的方案推荐，从每个样品中提取300 ng总RNA转化为双链cDNA。利用含有dUTP的dNTP混合物，通过随机引物反转录再生cDNA。该片段，末端标记的cDNA与Gene Chip®Human Gene 1.0 ST阵列杂交16小时，在45°C和60 rpm下，结合生物素化的双脱氧核苷酸的末端转移酶反应。杂交后，在genchip Fluidics Station 450®(Affymetrix)中对芯片进行染色和洗涤，并使用genchip Array扫描仪3000 G7®(Affymetrix)扫描。为了确定基因是否在分离的组织组之间有差异表达，对鲁棒多平均(RMA)表达值进行了单因素方差分析。采用了多次测试修正价值的价值-statistics调整错误发现率。基因与调整统计提取值<0.05。选择在Gingiva或DF中高度表达的基因，并且选择在对照的信号值与试验组之间表现出大于4倍的差异进行进一步研究。然后根据与基因函数相关的信息，分类这些基因，这些信息来自Kegg Pathway数据库的基因本体中可用（http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)．该微阵列数据集由基因表达综合（Geo）批准（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）;该数据集的GEO登录号为GSE58480(牙龈)和GSE51342(牙滤泡)。

２.３.定量rt - pcr

使用500ng提取的总RNA制备聚合酶链反应（PCR）分析所需的单链cDNA作为逆转录（RT）的模板（上标III逆转录酶和随机引物，Invitrogen，UK）。将Rt反应在65℃下温育5分钟，然后在25℃（5分钟），50℃（1小时）和70℃（15 min）下灭活逆转录酶的活性。将合成的cDNA在蒸馏水中稀释1：10，用作使用ABI7300 RT-PCR系统（Applied Biosystems，英国）的定量RT-PCR的模板。样品以三份制备，体积为25 μ.L包含1x Universal TaqMan Master Mix (4369016, Applied Biosystems)， PCR引物在0.9μ.M，稀释后的cDNA。扩增条件为50°C 2分钟和95°C 10分钟，然后是95°C 15秒和60°C 1分钟的40个循环。TaqMan基因表达检测引物(Applied Biosystems): KRT6A、CXCL10、CSTA、AMBN、ADAM12、CXCL12、cMYC、KLF4、SOX2、CD106 (VCAM1)、CD166 (ALCAM)、18S rRNA。我们选择了代表这两种组织的已知基因和参与其生理功能的鲜为人知的基因。

ABI 7300 SDS 1.3.1软件(Applied Biosystems)记录了报告染料和猝灭染料的荧光强度，并绘制出随时间变化的结果，用周期数表示。在本底(阈值循环数，Ct)以上的产物积累的早期对数期，对扩增图进行检测，以获得对初始靶标的精确定量。Ct值(阈值周期(Ct)数)随后用于确定ΔCt值(ΔCt =基因Ct减去18S rRNA对照Ct)。应用该方程，将相对表达式表示为相对变化量（ΔΔct;ΔCt值的差异）。所有这些定量的RT-PCR程序都完成了获得三次数据。使用SPSS 20软件（SPSS Inc.，IL，USA）分析结果。统计差异由Mann-Whitney计算测试,被认为是统计学意义的。表中列出了每个基因的特定引物测定ID和产品尺寸1．


基因符号	功能	测定ID	产品尺寸(bp)

KRT6A	异位发育，细胞增殖的阳性调节，细胞分化	Hs01699178_g1	83.
CXCL10	白细胞，趋化性的正规调节	Hs01124251_g1	135.
CSTA	角质形成细胞分化，肽酶活性的负调节	Hs00193257_m1	114.
Ambn.	含牙本质的牙齿的细胞增殖、骨矿化、牙形成	Hs00212970_m1	61.
ADAM12	细胞-细胞和细胞-基质的相互作用，包括受精，肌肉发育，神经发生	Hs01106101_m1	54.
CXCL12	免疫应答，单核细胞趋化性的正调节	Hs03676656_mH	88.
c-myc.	转录调节，DNA依赖性	HS00153408_M1	107.
KLF4	中胚层细胞命运测定，细胞增殖的负调节，转录调控	Hs00358836_m1	110.
SOX2.	RNA聚合酶II启动子转录负调控，成骨细胞分化	HS01053049_S1	91
CD106	反应缺氧，急性炎症反应，慢性炎症反应	Hs01003372_m1	62.
CD166	细胞粘附，信号转导，电动机轴突引导	HS00977641_M1	103.
18s rrna.		HS03003631_G1	69.

２.４.免疫组织化学染色

对于免疫组织化学染色，将牙龈组织和DF组织固定在10％缓冲福尔马林中，嵌入在石蜡中，然后以3的厚度折叠 μ.m。将试样用IHC染色与CXCL10的抗体（兔多克隆，稀释1：50; AB9807，ABCAM，剑桥，英国），CSTA（兔多克隆，1：2,000; AB61223，ABCAM），AMBN（兔多克隆，稀释1：200; AB116347，ABCAM）和CXCL12（兔多克隆，稀释1：50; AB9797，ABCAM）。通过加入3％过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶活性。将该部分在5％牛血清白蛋白中温育，以阻断非特异性结合。稀释初级抗体以促进最佳染色，并将部分孵育过夜。孵育后，施用Envision +系统HRP标记的聚合物抗兔（K4003，Dako North Americal，Inc.，USA）施用20分钟。根据制造商的说明，使用标记的链霉抗生物素蛋白生物素盒（DAKO）进行显色。

结果

3.1。Gingiva和牙卵泡的基因表达谱

33,297（3.6％）基因中的1,182个基因显示出至少4倍的绝对表达变化。在Gingiva中，555基因的表达水平高于DFS中的4倍，而DF在DF中的表达水平比在牙龈中的表达水平高至少4倍。通过标准化日志强度与平均强度的比率的密度和箱图来确认整体数据分布和频率。最终，进一步分析了829个基因，除了具有未知生物学功能的几种基因。数据进一步过滤，基因列于表格中2和3.根据他们的相对生物学功能。在牙龈中，与DF相比，387个基因的表达水平通过4倍或更多，而442基因的表达水平与牙龈相比，在DF中的4倍上调4倍。


功能类别	基因符号	生物过程	加入数量	绝对折叠变化	标准偏差

新陈代谢和分解代谢	LIPK	脂质分解代谢过程	NM_001080518	90.99.	11.87
	FMO2.	有机酸代谢过程	NM_001460	34.26	7.05
	__arg1	精氨酸分解蛋白过程	NM_000045	18.91	5.06
	LIPN	脂质分解代谢过程	NM_001080518	13.27	4.19

蛋白质修饰与维持	klk7.	蛋白水解	nm_139277.	30.47	6.52
	KLK10	蛋白水解	nm_002776.	28.97	6.34
	klk6.	蛋白质自动处理	nm_002774	25.58	6.10
	TGM1	蛋白质改性过程	nm_000359.	22.21	5.48
	ocln.	蛋白质复合体组装	nm_002538	12.48	4.48

结构的过程	Sprr2a.	角质化	NM_005988	207.84	18.61
	KRT1	角质化	NM_006121	146.08	15.41
	CNFN.	角质化	nm_032488.	74.92	10.64
	CSTA	角质形成细胞分化	nm_005213	69.63	10.22
	KRT4	细胞骨架组织	NM_002272	39.48	7.50
	KRT3	细胞骨架组织	nm_057088.	36.71	7.23
	焦距	角质形成细胞分化	NM_002016	24.31	5.75
	DSP	角质形成细胞分化	NM_004415	17.15	5.22

运输活动	CLCA4	离子传输	nm_012128	48.96.	8.48
	AQP3.	水路运输	nm_004925.	27.74	6.41
	SLC5A1	跨膜运输	nm_000343.	19.52	5.09
	GLTP.	醣脂类运输	NM_016433	7.56	3.04

发展过程	KRT10	表皮发育	nm_000421.	152.93	15.74
	scel.	表皮发育	NM_144777	134.38	14.68
	KRT6B	Ectoderm发展	NM_005555	90.30	12.11
	KRT6A	Ectoderm发展	NM_005554	57.61	9.64
	SPINK5	表皮细胞分化	NM_001127698	55.60.	9.34
	EHF.	上皮细胞分化	nm_012153	14.27	5.50
	SOX2.	胚胎发育	NM_003106	8.67	3.34
	TUFT1	牙发生	nm_020127	7.87	3.19

生理过程	rhcg.	调节pH值	nm_016321	51.23	8.68
	ABCA12	细胞稳态	NM_173076	39.33	7.55
	Ereg.	血管生成	nm_001432.	13.04	4.29
	nmu.	胃酸分泌物	nm_006681.	12.72	4.05
	镜头分割	氧化还原	NM_005063.	4.35	2.25

核酸合成和改性	MACC1.	细胞分裂调节	NM_182762	20.30	5.38
	ESRP1.	信使rna加工	NM_017697	17.02	5.85
	HIST1H1B	核心组装	NM_005322	6.85	2.91

信号转导与调控	il1f9.	细胞 - 细胞信号传导	NM_019618	26.31	6.03
	ARAP2	信号转导	NM_015230	9.88	3.89
	DAPP1	信号转导	nm_014395.	8.90	3.32

凋亡	MAL	诱导凋亡	nm_002371.	49.41	8.48
	ALOX12	Antiapoptosis	NM_000697	31.70	6.69
	FAM3B	凋亡	nm_058186.	27.28	6.16
	bnipl.	凋亡	nm_001159642	18.88	5.01

细胞粘附	CLDN17.	细胞 - 细胞粘附	nm_012131	91.67	11.90
	CRNN.	细胞 - 细胞粘附	NM_016190	71.09	10.39
	DSC3	同性恋细胞粘附	NM_024423	27.40	6.38
	CDSN.	细胞粘附	nm_001264	26.60	5.80
	DSG3	细胞粘附	NM_001944	23.82	7.07

细胞周期与转录调控	grhl1.	调节转录	NM_198182	31.32	6.62
	IRF6.	细胞周期逮捕	NM_006147	13.05	4.87
	Casz1.	调节转录	NM_001079843	4.29	2.27
	E2F8	调节转录	NM_024680	4.20.	2.21

免疫和炎症过程	SerpinB4.	免疫反应	nm_002974	73.33	10.65
	il1f6.	炎症反应	NM_014440	43.13	7.87
	il1rn.	炎症反应	nm_173842	26.09	6.48
	il1a.	炎症反应	nm_000575.	23.93	5.74
	CD1A.	免疫反应	nm_001763.	4.16	2.19

细胞因子和趋化因子活性	CXCL17	趋化性	nm_198477.	11.34	3.83
	CCL21	趋化性	nm_002989.	6.25	2.78
	anln.	cytokinesis.	nm_018685.	5.84	2.63
	CXCL10	趋化性	NM_001565	4.29	2.37


功能类别	基因符号	生物过程	加入数量	绝对折叠变化	标准偏差

新陈代谢和分解代谢	ALDH1L2	碳代谢过程	nm_001034173	19.63	5.13
	MOXD1	组氨酸分解过程	NM_015529	17.92	4.91
	ELOVL2	脂肪酸代谢过程	NM_017770	12.62	4.07
	FBXL7.	蛋白质分解代谢的过程	nm_012304	8.58	3.27

蛋白质修饰与维持	ADAM12	Metalloendopeptidase活动	nm_003474.	37.09	7.25
	MMP16	Metalloendopeptidase活动	NM_005941	24.32	5.82
	MMP2.	Metalloendopeptidase活动	nm_004530.	19.64	5.17
	MMP8.	Metalloendopeptidase活动	NM_002424	11.86	3.89
	MMP13	Metalloendopeptidase活动	NM_002427	7.60	3.16
	ADAM22	蛋白水解	NM_021723	5.97	2.75

结构的过程	COL11A1	细胞外矩阵组织	nm_001854	29.15	6.38
	MAP1B.	微管形成包	NM_005909	10.30	3.61
	FBN2	解剖结构形态发生	nm_001999.	9.02	3.40
	亮度	胶原蛋白原纤维组织	nm_002345.	8.68	3.32

运输活动	kcnt2.	离子传输	NM_198503	11.30.	3.80
	ABCC9	钾离子运输	nm_005691.	11.18	3.77
	rhobtb3.	逆行运输	NM_014899	10.62	3.72
	SLC4A4	钠离子传输	NM_001098484	10.12	3.68
	HEPH	铜离子运输	nm_138737.	8.34	3.28

发展过程	Ambn.	牙发生	nm_016519.	117.54	16.99
	CDH11	骨化	nm_001797.	38.12	7.40
	ALPL	生物纲组织开发	NM_000478	33.21	6.83
	aspn.	骨矿化	NM_017680	33.05	6.85
	FGF7.	胚胎发育	NM_002009	29.53	6.44
	COL1A2	骨骼系统开发	NM_000089	14.50	4.41
	runx2.	骨化	NM_001024630	13.85	4.23
	PDGFRB	胚胎发育	nm_002609.	11.85	3.93
	WNT2	间充质细胞增殖	NM_003391	10.28	3.73
	BMP5	骨化	nm_021073.	7.13	3.28
	LEF1	WNT受体信号通路	NM_016269	5.83	2.66
	pax3.	器官形态发生	NM_181457	4.70	2.38
	MSX1	器官形态发生	NM_002448	4.23	2.24

生理过程	VAT1L	氧化还原	NM_020927	12.30	3.98
	活性因子	凝血	nm_006287.	9.49	3.49
	TPM1.	肌肉收缩	nm_000366.	8.78	3.30
	SOBP	感官知觉	NM_018013	8.27	3.21

核酸合成和改性	eya4.	DNA修复	nm_004100.	24.90.	5.86
	NAP1L3	核心组装	nm_004538.	16.47	4.68
	SNRPN.	RNA拼接	BC043194	5.05	1.58

信号转导与调控	PDE7B	信号转导	nm_018945.	22.99	5.59
	CHN1.	信号转导	nm_018945.	22.98	5.60
	LIFR	Cytokine-mediated信号通路	nm_002310.	8.78	3.31
	FSTL1	BMP信号通路	NM_007085	8.75	3.31

凋亡	Sema3a.	凋亡	nm_006080.	51.87	8.72
	PEG10	凋亡	NM_015068	21.89	5.43
	SULF1.	凋亡	NM_001128205	11.18	3.77
	NELL1.	诱导凋亡	nm_006157.	8.67	3.27

细胞粘附	OMD	细胞粘附	NM_005014	40.83	7.69
	vcan.	细胞粘附	NM_004385	35.76	7.25
	Spon1.	细胞粘附	NM_006108	32.63	6.78

细胞周期与转录调控	myef2.	转录	NM_016132	6.71	2.88
	SYCP2.	细胞周期	NM_014258	5.41	2.53
	APBB2.	细胞周期逮捕	nm_004307.	5.25	2.49

免疫和炎症过程	TPST1	炎症反应	NM_003596	9.00	3.34
	PXDN	免疫反应	NM_012293	8.89	3.40
	IFI44L	免疫反应	NM_006820	6.01	2.79
	PECAM1	吞噬作用	NM_000442	4.26	2.25
	COLEC12	吞噬作用,识别	NM_130386	4.23	2.22

细胞因子和趋化因子活性	CXCL12	趋化性	nm_000609.	11.04	3.79
	塞子3.	趋化性	NM_003062	8.94	3.34
	CMTM3	趋化性	nm_144601.	5.24	2.52
	STX2	cytokinesis.	NM_194356	4.39	2.27
	CCR1.	趋化性	nm_001295.	4.31	2.36

3.2。基因本体学分析

为了识别选定基因的生物学功能和特征，使用DAVID网络工具将表达数据集组织成基因本体论联盟(GO)组。然后根据来自KEGG Pathway数据库的基因本体论中的基因功能信息对这些基因进行分类。数字1显示被分析的两个数据集的GO类(统计)．

共66个编码代谢和分解过程的基因在牙龈中比在DFs中表达更多。55个与角化和细胞骨架组织等结构过程相关的基因在牙龈中有较高水平的表达。另一方面，92个与发育过程相关的基因在DFs中高度表达，这是牙发生、骨化和骨矿化等生物学过程的结果。细胞周期相关基因和信号转导及调控相关基因在DFs中表达水平较高。这些结果与DFs高增殖率的发生相一致。

3.3。使用定量RT-PCR确认基因差异表达

定量RT-PCR分析验证了cDNA微阵列结果。六个基因，其中牙龈和DFS之间的表达水平差异为至少4倍。Mann-Whitney“”的检测，以关联相对变化与差异表达的PCR检测。表达水平KRT6A，CSTA，和CXCL10是，，和牙龈的时间更高，和Ambn.，ADAM12，和CXCL12是，，和dfs中的时间（图2)．这些结果与微阵列的结果一致。

3.4。通过免疫组织化学染色验证阵列结果

以下四种蛋白是IHC研究的目标:CXCL10，CSTA，Ambn.，和CXCL12(图3.)．CXCL10牙龈上皮区广泛染色。CSTA所有牙龈层都被强烈染色。Ambn.牙龈内无染色，但在DFs外围有染色。CXCL12在单个细胞层和DFS的胶原结缔组织中染色。结果与蛋白质水平的cDNA微阵列分析的结果一致。

图3.

通过免疫组织化学（IHC）染色验证微阵列结果。血毒素 - 曙红染色在牙龈（A，F）和牙卵泡（DFS）（K，P）（Asterisk：邻近肺泡骨）中的染色剂染色。IHC染色CXCL10在Gingiva（B，G）和DFS（L，Q）中。IHC染色CSTA(c, h)和DFs (m, r)CXCL10和CSTA在牙龈上皮细胞上显着染色。免疫组化染色Ambn.(d, i)和DFs (n, s)。在DFs外层周围染色。免疫组化染色CXCL12在Gingiva（e，j）和牙卵泡（o，t）。CXCL12在细胞层和DFS的胶原结缔组织中染色（秤条：200 μ.m）。

3.5。表面蛋白质标志物的茎表征

基于先前的研究，使用表面蛋白质标记表征牙科干细胞[16.，17.］．干细胞标志物基因的比较表达结果列于图中4（a）．我们的结果表明，DF组织来源的间充质间充质干细胞是一种对间充质间充质标记(包括CD13，CD34，CD73，CD90，和CD105.）根据国际细胞疗法协会[18.］．四种诱导多能干细胞（IPSCS）标记基因的比较表达（即，OCT-3，4，SOX2.，CMYC.，和KLF4)在牙龈中表达较高。作为qRT-PCR的结果，SOX2.，KLF4，和CMYC.距牙龈和12.5,12.43和12.23倍，距戈皮亚和12.5倍。vcam1（CD106）和alcam（CD166）在DFS中占33.54和4.27倍（图4（b）)．而oct - 3,4与其他标志物比较差异不明显(差异0.46倍)。

（一种）

（b）

图4.

dental-derived干细胞的相对基因表达和诱导多功能干细胞标记使用互补脱氧核糖核酸微阵列(a)。相对折叠五干细胞标记物的表达差异基因之间的齿龈和牙科使用定量rt - pcr (b)卵泡。并给出了数据平均值+标准偏差(,B)并应用方程表示为相对变化（b）。．

4.讨论

本研究采用cDNA微阵列比对分析，重点研究儿童牙龈和DFs基因表达谱的差异。以4倍绝对变化临界值计算，大部分基因(33297个基因中的32115个，96.5%)的表达水平与DFs相似。这些基因大多编码细胞粘附蛋白、参与结构过程的蛋白或与信号转导和调控相关的蛋白。这一发现表明，尽管牙龈和DFs起源于外胚间充质细胞，但它们后来分化为不同的组织。这可能是由于类似的细胞内信号通路的调节。相比之下，大约4%的基因在选择阈值以上差异表达。虽然这些基因只占整个基因序列的一小部分，但它们可能具有不同的生物学功能，并在表型和形态上相互区分。为了研究这一假设，我们从基因的生物学功能方面分析了比较基因表达。

在牙龈，KRT1，CSTA，和焦距在显着更高的水平上表达。牙龈上皮是分层鳞状角质化组织，这些基因与角蛋白化或角质形成细胞分化有关。KRT1标记分化的角化途径，并在角化区域表达[19.］．CSTA是角质形成细胞的角膜细胞包膜的前体蛋白之一，并在表皮发育和维护中起作用[20.］．焦距对调节表皮内环境稳定至关重要，并与角蛋白中间丝相互作用[21.］．表皮和外胚层显影相关基因在Gingiva与DF中强烈上调。KRT6B和KRT6A在牙龈上显着上调，分别具有90.30-10-57.61倍的差异表达。在皮肤损伤后迅速诱导这些蛋白质在伤口近端表皮角质形成细胞中，并调节伤口修复过程中皮肤角蛋白细胞的迁移潜力[22.］．scel.可能在角质化包膜中蛋白质的组装或调节中起作用[23.］．这些基因的上调可能表明牙龈内存在快速的周转率，并可能促进成纤维细胞增殖，这是组织修复的重要事件。

口腔黏膜受到各种外在因素的影响，如化学物质和微生物。与细胞凋亡和趋化有关的基因CXCL10，CXCL17，anln.，和CCL21在牙龈强烈表达。CXCL10由角蛋白细胞分泌，是宿主免疫反应的标志物[24.］．这种趋化因子在渗透到Th1细胞中起着重要作用，通过加剧牙周病来影响牙龈的牙龈[25.］．这些趋化因子的过度表达可能与牙龈免疫和炎症反应的产生和传递有关。

另一方面，与牙齿和胚胎发育相关的基因在DFS中表现出显着更高的表达。这些结果与先前的DF基因表达研究的结果一致，使DFS与PDL进行比较[14.］．增加的表情Ambn.表明DFS在搪瓷矩阵形成和矿化中发挥着重要作用[26.］．在这项研究中，WNT2和LEF1表明DFs参与了调节牙齿起始和形态发生的信号因子的复杂相互作用[27.，28.］．runx2.是成骨细胞标记基因的关键调节剂，并促进间充质干细胞分化为成骨细胞。文献表明runx2.牙间充质细胞的功能，并在牙齿发育过程中调节从牙上皮细胞到间充质细胞的信号传导[29.］．它还影响调节牙爆发的分子事件 - 最重要的生理作用可能在爆发部位进行[30.］．考虑到DFs的适应性作用，这些基因的存在表明DFs在牙齿形成中起着核心作用。

编码蛋白质改性和信号转导相关蛋白的基因倾向于在DF中的较高水平表达而不是在牙龈中。金属蛋白酶亚当12.已经涉及到生物过程，包括受精和神经发生在DFs [11.］．MMP-13可能是一种主要的胶原分解酶，在牙齿萌出时降解细胞外基质。MMP-13的上调表达说明DFs对配合出牙有重要作用[31.］．CXCL12是间充质干细胞的趋化因子，并介导这些细胞对骨酸发生的抑制作用。在牙齿发育期间，该因子可以在DFS中表达，包括围绕显影牙芽的上皮[32.］．

为了验证cDNA微阵列结果，选择六种不同函数的不同函数用于定量RT-PCR分析。表达水平KRT6A，CSTA，和CXCL10在牙龈中上调;Ambn.，ADAM12，和CXCL12在DFs中上调。这些结果与微阵列的结果一致。为了更好地了解差异表达基因的作用，我们进行了免疫组化分析，以确定其在组织水平上的功能。CXCL10和CSTA在牙龈组织的所有层中被强烈染色，但在DFS中没有染色。在牙龈中高度表达的基因染色在上皮内，因为牙龈和DFS之间的结构突出差异位于角质化上皮中。Ambn.和CXCL12DFs外区广泛染色，特别是在减少的釉质上皮。

具有干细胞性质的几种细胞群已从牙科组织的不同部分中分离出来。提出了他们参与组织修复和维护[1］．虽然很难用表面蛋白标记物来描述牙干细胞的特征，但我们的研究结果表明，重要标记物包括CD13、CD34、CD73和CD105在DFs中相对过表达。这些基因在所有牙干细胞或前体细胞中普遍表达[6，16.］．除了CD90、CD13和CD34在以往的研究中经常被引用为牙源性干细胞标记物外，我们选择了CD106(VCAM1)和CD166(ALCAM)，在牙滤泡中表达更强烈。其他牙源性茎标记基因，包括CD29、CD90和CD73的表达水平较高，表明DFs具有自我更新和分化能力[33.］．

有趣的是，牙龈表达了高水平的ips相关标记(OCT4，CMYC.、SOX2和klk4）和DFs (34.］．这些蛋白质是转录因子，对维持自我更新能力或多能性至关重要[35.］．IPS细胞在传统的MSC上提供了优势，因为它们显示了可以作为无穷性的干细胞来源的无限增长能力[36.］．与来自人体的其他成熟体细胞（如成人MSC和成虫成纤维细胞）相比，类似的可比报告分析了牙科组织衍生的间充质样干细胞可以更有效地重新编程为IPSCs。37.］．

牙科组织的可及性，包括MSCs，可能仍然有限，因为这些细胞只能在特定情况下被隔离，例如在齿的提取期间。然而，Gingiva是通过活组织检查收集的最方便的组织之一，具有较少的瘢痕形成和更少的后尿剂供体不适。此外，在儿童的牙科手术期间常规切除牙龈组织，例如受延迟喷发的牙齿的手术提取和外科手术，这些组织通常被视为生物医学废物。在实验室中，将基于其高增殖性质分离从牙龈组织中分离干细胞也是可行的。因此，牙龈可以是再生牙科干细胞的重要替代源。如果从牙龈组织中分离的干细胞可以类似于脐带血的储存，则这些细胞的动态特征揭示了它们的使用潜力。尽管该研究仅限于监测表达模式而没有临床链路，但不同组织的比较基因表达分析可以提供有关功能的遗传信息，例如组织修复和牙齿发育。需要进一步调查来评估基于本研究的牙龈细胞的神经发生能力，矿化潜力和细胞增殖能力。

5.结论

这项研究首次揭示了牙龈和DFs之间的基因表达差异。采用cDNA芯片对茎干分子指纹图谱进行表征和比较。基于其生成牙骨质、骨和PDL的能力，DFs被认为是一种多功能组织。虽然之前没有发现牙龈具有多能干细胞性，但这项研究表明，iPS细胞的转录因子在牙龈中表达水平较高，大多数牙源性干细胞标记物在DFs中强烈上调。考虑到最小的术后不适和简单的牙龈组织，牙龈是一个很好的候选干细胞来源在再生牙科。

信息披露

资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。

利益争夺

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者非常感谢所有参与者的合作。该研究得到了由教育部，科学和技术部（2011-0022160和2012R1A1041910）资助的韩国国家研究基金会基础科学研究计划的支持。

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干细胞国际

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摘要