鸡诱导多能干细胞样细胞的维持和神经分化

摘要

多能干细胞具有成为成人体内的任何细胞，包括神经元和胶质胶质。禽干细胞可用于研究问题，如声乐学习，这很难用传统的小鼠模型检查。诱导的多能干细胞（IPSC）是将分化细胞被重新编程为多能干细胞状态，通常使用诱导基因或其他分子。我们最近使用哺乳动物基因成功地成功地产生了禽IPSC的细胞，克服了非酰胺类别中IPSC的产生和使用的限制（Rosselló等，2013）。然而，禽IPSC没有建立最佳的细胞培养条件，以建立长期细胞系，从而研究神经元分化体外．本文提出了一种有效的维持鸡ipsc样细胞并将其分化为动作电位产生神经元的方法。

1.介绍

多能干细胞是一种未分化的细胞，在成人体内可以分化成任何类型的细胞。它们有两个主要特征。首先，与分化的体细胞不同，干细胞具有自我更新和增殖的能力。第二，它们有能力分化成性质截然不同的体细胞。目前有两种主要的方法可以用来获得或创造干细胞体外．首先是从早期胚胎中分离胚胎干细胞（ESC）。第二代是诱导来自体细胞的多能干细胞（IPSC），例如成纤维细胞，首先通过四转录因子的组合进行说明：OCT4，SOX2，KLF4和C-MYC [1］．

虽然ESC和IPSC都可以分化为体细胞，但两种类型的干细胞之间存在差异，仍然引起IPSCs是否能够完全重新承载多能ES细胞的特征。这些包括IPSCS遗传改变从含有重编程转录因子的病毒载体的整合到宿主基因中[2[表观遗传修饰，如DNA甲基化和组蛋白激活[3.］．即使经过重编程，诱导多能干细胞仍然保留其来源组织的记忆(尽管可能仅限于早期传代)，这可能会限制它们分化为其他类型的细胞[4.那5.］．有时分化限制随着诱导多能干细胞传代数量的增加而减少[6.］．因此，由于ESCs和iPSCs之间可能存在差异，因此验证任何系产生的iPSCs的差异和发育特性非常重要。

鸟类是研究发展的重要生物，包括神经发展[7.］．使用鸡作为模型生物的优点是监测其胚胎发育的能力在ovo.．然而，鸟类研究的一个局限是，用于研究细胞功能的细胞系很少。因此，我们的目标之一是创造鸟类干细胞，可以用来研究神经元功能。为了实现这一目标，我们最近成功地利用哺乳动物中诱导iPSC转录因子的同源物来诱导部分类iPSC细胞，包括鸟类、鱼类和其他动物果蝇[8.］．我们能够展示在活的有机体内在鸟类和鱼中掺入和分化细胞，但不能获得稳定的细胞系，这些细胞系在许多段落中。在这里，我们开发了新颖的媒体条件，使我们能够在20段段落中保持这些相同的禽流群，我们能够将它们分化为神经元体外．

2。材料和方法

起始成纤维细胞和初始IPSC样细胞与Rosselló等人的细胞相同。[8.］．然而，与那项研究不同，在这项研究中，在转导的第一周后，我们将细胞的生长与不同的媒体条件进行了比较。在以前的研究中，在相关的情况下，将提到当前研究中作为制备未发表的研究结果。

２.１.胚胎成纤维细胞提取

如Rosselló等人所述[8.]，取新鲜鸡蛋37℃孵育2-4天，于胚胎第12天采集小鼠胚胎，获得胚胎成纤维细胞。用钳子取出胚胎，分离腹部和头部。其余胚胎在37°C下用0.25%胰酶与EDTA (Gibco)分离，直到获得单细胞悬液。然后用KO DMEM (Gibco 10829)和15% FBS (HyClone)中和胰蛋白酶。1500rpm旋转细胞5 - 7min，抽吸上清。然后将细胞置于15cm细胞培养板中，每板1个胚胎，添加KO DMEM和15%胎牛血清，并分别在39°C(鸡)或37°C(小鼠)中，在5% CO中孵育₂氧气21％的气氛。孵育两天后，将细胞在1：4稀释时传代一次，并如下所述翻译两天后转染或转染。

２.２.诱导多能干细胞转导与培养

如Rosselló等人所述[8.鸡肉或小鼠胚胎成纤维细胞在2I +修饰的培养基（见下文）中，与含有小鼠OCT4，SOX2，KLF4和C-MYC基因的StemCCA病毒载体（LTV-201）（LTV-201）中[9.］．我们通常在12孔细胞培养板（康宁，3.8厘米）中转导12-24个独立的成纤维细胞复制培养物²)．在CESC介质中转导后一周，然后通过试验和误差在每个条件下的4个独立重复中进行许多不同的媒体条件组合传代，其中五个我们在此报告的比较目的（表1见下文）。由于12-24孔板中的每一个相同的4个孔中的同时进行不同的介质条件，这对实验板，培养箱或其他变量相同进行。

２.３.增长的媒体环境

BRL（水牛鼠肝脏）条件媒体加．90% KO DMEM (Sigma) + 10% FBS (Hyclone)用水牛大鼠肝细胞预处理3天，形成BRL条件培养基。然后每100ml BRL条件培养基中加入以下标准细胞培养成分(总生成150ml): KO DMEM (15ml)、FBS (7.5 mL)、100mm丙酮酸钠(1.5 mL)、100x非必需氨基酸(1.5 mL;Sigma)， 100x青霉素-链霉素(1.5 mL, Sigma)， 100x核苷(1.5 mL，微孔)，100x谷氨酰胺(250μ.L，生命技术)和-巯基乙醇(190μ.l，sigma）生成“BRL条件加”媒体，最终浓度如表所列1．该培养基已用于种植鸡原毒细胞（PGCS; [10)，只是我们省略了鸡血清。

CESC（鸡胚干细胞）媒体．这种培养基是基于撒玛拉特和痛苦[11目的是支持鸡ESCs的增殖。它被用来培养我们最初的类ipsc鸟类细胞，持续到Rosselló等报道的第5代。[8.］．它由标准介质组成，具有FBS和谷氨酸浓度的差异和LiF（Millipore LiF2010）和下列重组细胞因子（表1）：RHIL6（PEPROTECH 200-06），RHSIL6RA（PEPROTECH 200-06R），RMSCF（PEPROTECH 250-03），RHIGF1（PEPROTECH 100-11）和rhFGF2（PEPROTECH 100-18B）。来自人（H）和小鼠（M）的LIF和重组细胞因子的目的是抑制分化。

2I +（三个抑制剂）+LIF媒体（2i +）．2i +培养基是基于[12-14含有3种抑制哺乳动物细胞分化的化学物质。标准的3i和LIF培养基包括LIF激活STAT3, CHIR99021抑制GSK3, PD0325901抑制MEK, PD184352抑制FGF受体酪氨酸激酶。我们发现，用抑制tgf - β的A83-01取代PD184352会导致看起来更健康的增殖菌落[13］．在我们的实验中，我们使用标准培养基条件(除了将FBS增加到15%，因为我们观察到细胞在15% FBS中增殖更快)，然后添加LIF和三种抑制剂:PD0325901 (Stemgent)， CHIR99021 (Stemgent)，和A83-01 (Tocris Biosci) [12］．

cESC和2i+ Media．这种培养基是cESC和2i+的结合(表1)．我们使用标准介质条件，包括15％的FBS水平，然后加入LIF，2I +（PD0325901，CHIR99021和A83-01），以及以与相同浓度的重组蛋白（RHIL6，RHSIL6RA，RMSCF，RHIGF1和RHFGF2）。多于。

修改了鸟类细胞的2i+媒体．我们尝试了不同浓度的LIF和2i+分子，得到了一种改良的禽类细胞增殖2i培养基。这个媒体的生成方式与我们的2i+媒体相同1)，但随着LIF的降低(从1000 U/ML到50 U/ML)， PD0325901增加(从0.5 U/ML到50 U/ML)μ.米1μ.m），CHIR99021没有变化（3 μ.m），并增加A83-01（从0.5 μ.米1μ.该培养基用于培养增殖能力更强的类ipsc鸟类细胞，其持续时间超过了[8.]，并且在撰写本文时仍在扩散。

２.４.生成和维护控制小鼠iPSC

我们在房屋小鼠IPSCS冷冻库存细胞用于对照实验。它们根据Rosselló等人描述的协议生成。[8.］．在细胞被解冻后，用CESC或改性的2I +培养基与鸡IPSC样细胞平行培养。

2.5。细胞培养的成纤维细胞饲养剂的有丝分裂抑制作用

小鼠成纤维细胞被扩增、胰蛋白酶化、照射，并等量储存在液氮中。在使用前1 - 5天，根据需要将辐照电池解冻并镀上。从鸡肉中提取的成纤维细胞以70%的一致性被放置到所需的细胞培养板上过夜，用于培养鸡的诱导多能干细胞样细胞。然后用浓度为10的丝裂霉素c (Sigma M-0503)灭活细胞μ.g/mL培养基在39°C下保存2.5小时。之后，用1xPBS (Gibco)洗涤细胞3次，并在鸡ipsc样生长所需的培养基中孵育过夜。将鸡的ipsc样细胞胰酶化(Gibco, 25200-056)，然后旋转下来，用新鲜培养基将其镀到有丝分裂灭活的小鼠或鸡成纤维细胞上。

2.6。从成纤维细胞中机械提取ipsc样菌落

鸡肉IPSC样细胞培养物的用干细胞和自增殖成纤维细胞的混合物用EDTA（Gibco）在室温下孵育30秒，同时前后​​轻轻摇动板。然后用改性的2I +培养基和置于解剖显微镜下的板中和胰蛋白酶。有500个 μ.L移液管，然后将干细胞菌落与成纤维细胞分离并虹吸到移液管尖端中。然后将萃取的菌落分别在12孔板或96孔板上孔的约3-5个或6.35mm的细胞培养板上置于细胞培养板上，分别在12孔板或96孔板上，（康宁），用新鲜改性的2i +培养基。然后将萃取的菌落在39℃，5％CO中培养为其他鸡IPSC样细胞培养₂和21％的氧气。

2.7。碱性磷酸酶染色

培养皿或玻片上的细胞用4%多聚甲醛水溶液在室温下固定10分钟。他们然后用三羟甲基氨基甲烷马来酸盐缓冲液洗2 - 3次(30毫米三pH值9.0)和碱性磷酸酶染色活动30分钟在室温下与刚做好的解决方案包含Naphtol-AS-MX-phosphate(σN5000)和快速红色TR盐(σF2768)与MgCl三羟甲基氨基甲烷马来酸盐缓冲液₂(10%)。然后用PBS洗涤，以停止颜色反应，并用含有DAPI (Vector Labs, H-1500)的Vectashield HardSet安装介质覆盖。

2.8。神经元分化

我们试图使用两种不同的协议生成从鸡IPSC样细胞中产生神经元：（1）干细胞技术ES-Cruct套件，使用Dish Embryoid Body方法完全如描述（干细胞技术，猫＃28706;生产终止）;（2）具有修改的差分方法[15］．修饰使用2种培养基补充物，N2 (Gibco 17502-048)和B27 (Gibco 17502-048)，这两种培养基通常与白血病抑制因子LIF联合使用，以维持ESCs和祖细胞的多能性。LIF是帮助细胞保持未分化状态的培养条件的主要组成部分。不含LIF的N2和B27用于维持神经元培养，并刺激干细胞和祖细胞分化成神经元。Lee等人使用的方法[15，有三个台阶。（1）我们首先在6cm的培养皿中形成了胚状体(EBs)，其中包含了用0.25%胰蛋白酶加EDTA (Gibco)胰酶处理过的ipsc样细胞。胰蛋白酶被淬火，细胞以1500转/分的速度旋转。然后这些细胞被重悬进去胚状体形成培养基（见下文）并在大约10次以超级粘附6孔细胞培养板（干细胞技术，猫＃27145）镀^6.每孔接种4天。细胞在2天内聚集形成EBs，培养4天以上时，EBs开始出现偶有节律的心脏样跳动。每孔细胞浓度的增加增加了EBs的大小和数量。（2）在EB形成4天后，将它们小心地转移到15ml管中，并通过重力沉降到管的底部。小心地吸出培养基，以免干扰EBS。然后重新播入EBS过渡媒体(见下文)，并被镀到聚l -鸟氨酸和层粘连蛋白涂层玻璃覆盖物上(BD BioCoat, 1232C71)，在24孔细胞培养板上复制。经过2 ~ 3天的培养，EBs完全附着在封面上。（3）然后我们继续培养细胞N2B27神经元分化培养基（见下文）7-10天获得功能性神经元。根据需要，用新鲜N2B27培养基取代2/3培养基。

胚状体形成媒体．这是没有细胞增殖抑制剂的标准培养基（表1)．标准成分比浓度为KO DMEM(81%)、FBS(15%)、丙酮酸钠(1 mM)、非必需氨基酸(1 mM)、谷氨酰胺(1 mM)、-巯基乙醇(0.005 mM)和青霉素/链霉素(1 mM)。

过渡媒体．该培养基是我们标准媒体的1：1混合物（表1，从KO DMEM到青霉素/链霉素）和基于LEE等人的N2B27神经分化介质。[15，但不含维甲酸。N2B27培养基由N2和B27培养基1:1混合制成，使用前分开存放。N2培养基由DMEM/F12 (99%， Gibco)、N2 (1%， Gibco 100x)和BSA (0.01%， Fisher)组成;B27由神经基底中膜(96%，Gibco)、B27 (2%， Gibco, 50x)、谷氨酰胺(1 mM)、青霉素/链霉素(1 mM)和-巯基乙醇(0.005 mM)组成。所有成分的最终浓度1:1混合过渡媒体N2B27和标准媒体KO DMEM(40.5%)的边后卫(7%)、丙酮酸钠(1毫米),不必要的氨基酸(1毫米),Glutamax(1毫米),beta-mercaptoethanol(0.005毫米),青霉素和链霉素(1毫米),DMEM / F12(24.5%)、氮气(0.25%,Gibco 100 x) neurobasal媒体(24%),B27 (0.5%， Gibco 50x)。

N2B27神经元分化介质．该培养基与上述N2B27相同，最终浓度为DMEM/F12(49%)、N2(0.5%)、BSA(0.005%)、神经基底培养基(48%)、B27 (1%， Gibco 50x)、谷氨酰胺(0.5 mM)、青霉素/链霉素(1 mM)和-巯基乙醇(0.005 mM)。

2.9。免疫细胞化学

玻璃盖上的分化神经元用4%多聚甲醛水固定15分钟，用1x PBS冲洗。然后用0.3% triton X-100和1x PBS在室温下渗透细胞30分钟，用适当的血清或1% BSA在室温下封闭细胞1小时。用一抗(NeuN, Millipore MAB377;MAB1637 TU-20,微孔;或Nestin, Millipore, MAB353)在PBS中1:100稀释1小时，然后二抗1:1000稀释1小时:NeuN与AlexaFluor488荧光二抗(分子探针)偶联;TU-20和Nestin与抗小鼠IgG二抗(Sigma, A3562)偶联，然后与耐牢蓝RR盐(Sigma FBS25)反应。然后将细胞生长的覆盖层安装在含有DAPI的Vectashield安装介质的玻片上。我们量化NeuN标记细胞的数量，方法是在一个100倍的视图中，从三个独立的重复中计数所有的细胞，将该数量除以总DAPI标记细胞，然后取平均值。

2.10。电生理学

将活神经元的覆盖物转移到含有标准细胞外溶液(mM: 140 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl)的记录室₂1.25 MgCl₂，1.25 nah.₂阿宝_4.，20 d-葡萄糖和10个hepes）。使用直立显微镜（Olympus BX51Wi与Lumplfln40xW目标）的DIC光学来建立全蜂窝录音。记录移液器的电阻范围为3至6MΩ，串联电阻<20mΩ。用Axoclamp 700b放大器和Digididata 1440（分子装置）测量和获取数据。内部电极溶液，IN mm，135k葡萄糖酸盐，2 mgcl₂，2 mgATP，0.5 nagtp，0.5 EGTA，10个HEPES和10个磷酸官（pH 7.35）。通过电流注射驱动细胞以测试作用电位的存在。

2.11。定量实时PCR

细胞被旋转下来，使用标准试剂盒（Promega SV总RNA分离系统，Z3105）提取RNA。在我们改变的2I +培养基条件下生长鸡IPSC样细胞，在相同的介质中生长对照成纤维细胞，并在分化介质中生长分化的鸡神经元。使用Nanodrop 2000c（Thermo Sciencific，Waltham，MA）量化RNA并储存在-80°C中。生产互补DNA（cDNA）（10 μ.L (2x) RT (1μ.L 20x上标II酶;应用生物系统）使用MJ Tetrad系统运行逆转录循环（循环：37℃，60分钟，95°C 5分钟，4°C保持）。然后使用CDNA作为模板，以使用Biorad CX96实时机使用具有定制Taqman引物探针（由应用的生物系统产生）或定制引物的基因表达测定，或者用1 μ.L SYBR绿色(BioRad)，在20μ.l含有1的反应 μ.模板(L ~ 2μ.G/μ.l），10 μ.L 2x基因表达大师混合(BioRad, Hercules, CA)。为了区分神经元和干细胞基因的相对表达，我们利用非重叠序列对小鼠和鸡进行了不同的引物筛选。探针包括鸡特异性Nanog (Gene ID NM_001146142.1, 5 ' -CAGCAGACCTCTCCTTGACC-3 '， rev引物3 ' -TTCCTTGTCCCACTCTCACC-5 ')、Oct4 (Gene ID NM_001110178, 5 ' -GGGAAGATGTTCAGCCAGAC-3 '， rev引物3 ' -GTCTGGTTCTGCAACCGGCG-5 ')和Sox2 (Gene ID NM_205188.1, 5 ' -TTTCCTAGGGAGGGGTATGAA-3 ')、Sox2 (Gene ID NM_205188.1, 5 ' -TTTCCTAGGGAGGGGTATGAA-3 ')。rev引物3 ' -GCAGAGAAAAGGGAAAAAGGA-5 ')测定鸡ipsc样细胞的干性;克莱斯勒(双肾上腺皮质激素基因ID NM_204335 5 -CGCTGAAAACCGCTTCAGAT-3,引物3 -ACTGCTCGAGGTCCCATTTG-5)牧师,巢蛋白(基因ID NM_205033.1 5 -GCAGAGCCAGAGCGCACCAA-3,牧师引物3“-CAGGCTCAGCCCCACTGTGC-5”),和beta-tubulin三世(基因ID NM_001031598 5 -GGCCTCCTCTCACAAGTACG-3,牧师引物3 -AAATGAAGTTGTCGGGGCGG-5)神经特异性;GMFB (Glia mature Factor B, Gene ID XM_418091.4, 5 ' - cgggcaggatggattttctct -3 '， rev primer 3 ' -GTACTCATTGGCCTCGTGCT-5 ')的胶质细胞特异性。所有引物均经过测试，效率均在90%以上，符合MIQE指南[16］．每个孔含有10x rt缓冲液（200mm Tris-HCl / pH 8.4; 500 mm KCl），25 mm MgCl₂, 1μ.L cDNA产物，10 mm DNTP和ITAQ DNA聚合酶。RT-PCR的循环条件如下：48℃，10分钟，95℃10分钟，其次为40℃，持续40℃，持续15秒（变性）和60℃，1分钟（退火）。为每个引物组，探针和端粒酶测定运行无模板控制分析。每种样品运行18S rRNA内源性对照（Taqman Man Primer：Cat＃真核18s RRNA HS9999901_S1;应用生物系统）。所有反应均在Quintuplets中进行。结果将结果归一化至内源18S rRNA表达（ABI）和使用DDCT方法对对照组的基因表达水平进行归一化[17］．对每个物种内基因表达的变化进行了差异分析。测量统计学意义．

2.12。MTT测定

用标准试剂盒进行MTT测定（Promega SV细胞滴度96非酰基活性细胞增殖测定，G4000）。在改性的2I +培养基中生长鸡成纤维细胞和鸡IPSC样细胞。在每篇通道之后，将细胞孵育24小时，并将试剂糖染料溶液加入到每个孔中，并在37℃下每试剂盒培养4小时。然后，每种方案加入溶解缓冲液并孵育过夜，并在570nm处读取吸光度。

结果

３.１.鸡ipsc样细胞的维持

我们研究的第一部分的目的是找到条件，使我们能够培养禽类的类ipsc细胞通过第5代，这是我们在cESC培养基中很难做到的[8.］．用各种细胞尝试了不同的媒体病症，包括从Bertrand疼痛，来自Marie-Cecile Van de Lavoir的鸡原毒细胞的鸡原毒细胞，以及我们衍生的鸡的IPSC。在这里，我们向比较目的报告五种媒体条件，使用以前的CESC媒体生长的先前生成的IPSC样细胞，包括以前的媒体条件作为基准。对于我们的通用方案，用含有四种诱导小鼠转录因子的StemCCA盒转染鸡胚成纤维细胞，并且在12-24孔的重复的标准介质条件下使用非杂种鸡胚成纤维细胞作为对照。1周后，将细胞传代一次，然后在4个分化抑制介质条件下最初转移和维持，以4：BRL条件加，CESC，2i +，CESC和2I +（表1:看到部分2用于详细的媒体组成）。以前的研究结果显示了，我们自己的结果已验证（未示出）BRL条件[18]和CESC媒体[11]足以分别维持鸡原毒细胞（PGC）和鸡胚，并且2I +培养基足以维持小鼠干细胞体外[12］．

在我们的实验中，在所有培养基条件下，鸡细胞在第1 -2代开始形成小的ipsc样的增殖细胞集落(图)1)，而成纤维细胞则没有。然而，在第2代和第5代之间的条件存在差异(量化见表2)．BRL条件介质中的殖民地非常小而黑暗，看起来很差，所有这些都是由第二段（几周内）迅速参加。通过观察少量剩余的菌落或增殖细胞，表征衰老。CESC中的细胞和2I +介质持续到第4段，但仅在〜50-70％的重复，然后由第五段参加所有这些（表2)．细胞在cESC + 2i+中并没有更好的生长，因为只有大约50%的细胞能存活到第6个传代然后停止生长(表)2)．然后，我们通过系统地降低和增加抑制剂(0.5μ.M递增）在媒体中。我们在鸡IPSC样细胞上测试了培养基的不同配方，我们可以清楚地识别哪种媒体通过第3或第4段辅助细胞的增长。我们发现降低了LIF和增加了两种抑制剂（PD0325901和A83-01）导致鸡菌落与第1段（图）相比，第二段经常出现更健康，更大的鸡菌落（图1(e))，生长超过20段(至表中第8段)2)，并且与小鼠iPSC对照组的速率相似(表2)．我们的小鼠IPSCS在CESC和改进的2I +媒体中增殖殖民地增长良好（表2)，说明用cESC培养基与鸡的差异可以反映物种差异。

与其他媒体条件不同，我们发现通过三个不同的阶段重复开发的修饰2I +介质中鸡IPSC样殖民地的形态。当首先转导细胞时，菌落表现出明显的圆形形状，具有深色的着色中心（图2（a）），即代表鸡胚干细胞的形态[8.］．经过大约4-5代后，当在其他培养基条件下的菌落开始衰老时，在改良的2i+培养基中的菌落失去了色素沉着，在菌落的外围开始出现成纤维细胞(图)2(c))。随后的菌落在没有成纤维细胞的情况下以稳定的速度开始生长(需要每2-3周稀释1:2)，然后在几天后出现成纤维细胞。当我们用500机械去除周围的成纤维细胞时μ.L吸管()，此时细胞停止增殖。当我们将它们置于经丝裂霉素c处理或辐照的小鼠或鸡饲料成纤维细胞(每种），干燥的细胞增殖甚至更大地降低。因此，我们能够维持生长的唯一方法是让修饰的2I +培养基中的细胞在该阶段生长期间产生外周成纤维细胞。然而，在第8-9段通过后，大多数菌落（> 65％±12％）开始失去成纤维细胞的发展及其圆形形态（图2(e))，尽管，即使在我们的普通小鼠ips和ESCs中，培养孔中仍有少量分化成纤维细胞样细胞。最后，在大约第12代后，细胞集落开始类似于小鼠ips细胞的形态，并以类似的速度增殖(每~7天稀释1:4)，如小鼠文献报道的[3.］．到目前为止，我们已经能够维持鸡IPSC样细胞的这种通道率超过一年，而不是每2-3周的1：2稀释以进行前一阶段。整个三个阶段的所有菌落仍然染色碱性磷酸酶（图2（b），2（d），和2(f))和表达内源性鸡干细胞诱导基因同源物(也见Rosselló等人[8.]）;周围的成纤维细胞没有染色碱性磷酸酶。因此，我们的修改2i +禽流群+媒体始终如一地实现了我们创造持续增长和禽类般性IPSC细胞的条件的目标。

整个三个阶段的菌落也表达了内源性的鸡干细胞诱导基因同源物(图3.；参见Rosselló等[8.])，并在最后阶段具有正常的核型(见Rosselló等[8.])。在这里，我们检查了高增殖的菌落。使用QRT-PCR与3个鸡特异性探针已知与多能性相关联，我们发现相对于非诱导的成纤维细胞，高增殖的鸡IPSC样细胞仍表达高水平的内源性纳米，OCT4和SOX2（图3.）;内源性KLF-4低，如普通鸡ESC的早期阶段（图3.；[8.])。因为用OCT4，SOX2，C-MYC和KLF-4的小鼠同源物转导鸡IPSC样细胞，所以鸡同源物的显着增加，包括Nanog，Nontronsuce的基因，表明内源性多能机械仍然存在整个最后阶段都活跃。类似地，MTT测定表明鸡IPSC样细胞保留了显着高的增殖（代谢）能力（图4.)．

3.2。鸡IPSC样细胞的神经元分化

我们将细胞在改良的2i+培养基中经过5代、8代、12代和20代后，试图将它们分化为神经元。我们首先尝试了干细胞技术(Stem Cell Technologies, ES-Cult, Cat#29706;但发现，尽管它们能够为小鼠生成神经元样细胞，但分化的小鼠细胞密度稀少，而禽类胚状体(第一步)难以附着在板上。然后我们尝试并修改了Lee等人的方法[15，不添加维甲酸，并使用我们的禽类标准培养基组成。我们发现，在这种改良的神经分化培养基中，鸡的ipsc样细胞经历了五个不同的分化阶段。

在第一阶段，当鸡的ipsc样细胞(图5.(a))置于胚体形成培养基中，置于超低附着板上，从板底脱落，着色，形成三维球，即EB(图)5.(b))。然后将这些EBs放入含有聚l -鸟氨酸和层粘连蛋白的玻片上的神经元过渡介质中数天，它们附着在玻片上并开始变平和扩散(图)5.(c))。然后将它们置于N2B27培养基中，在接下来的7天内，细胞迁移离开EB并开始形成神经突(图)5.(d))。在N2B27培养基中12至14天后，这些差异细胞显示出明显的神经元形态（图5.（e））。在原始EBS中剩余的细胞本身呈神经缺卵状形态，具有玫瑰花状结构（图5.(d);[19])。

我们发现分化细胞在第7天已经表达NeuN(图6.(i))，一种神经元核抗原[20.］．这甚至是一些尚未具有明显神经元过程的细胞的情况，表明细胞是神经元前体。标记的细胞倾向于远离神经缺卵细胞（图6.（F））。Neun染色（绿色）和DAPI核染色（蓝色）的分致化表明抗原主要在细胞的核中正确表达并在细胞质中的较小程度上表达（图6.（手6.（一世）;[20.])。第5代和第8代分化的NeuN细胞密度为56%(±11.6%)，第12代和第20代分化的NeuN细胞密度为56.3%(±5.46%)。相比之下，只有密度相似的初始鸡ipsc样细胞的孔中，NeuN标记的细胞在0到2个之间。

在神经元分化的14天后，为Nestin，中间丝蛋白染色的细胞，即优先在神经元SOMA的细胞质中表达（图7.（C）） [21，并对β -微管蛋白III (TU-20)进行染色，该蛋白可标记神经元微管，常表达于神经元轴突和树突(图)7.(d))。TU-20标记使我们能够可视化神经元过程，可以看到细胞形成连接或至少通过这些过程在封面上长距离地相互接触(图)7.(d))。如此漫长的过程只有在14天之后的古老文化中才能看到。启动鸡的ipsc样细胞没有显示分化过程，也没有对NeuN、Nestin或TU-20进行染色(图)6.（c）和数字7.（a）和7.(b))。这些结果表明分化的细胞表现出神经元形态和抗原在起始细胞中不存在。

通过鸡IPSC样细胞中的神经元标记物，巢蛋白和β-微管III的神经元标记物的神经元的QRT-PCR进一步支持分化细胞的神经元相同。（图3.)的相对表达明显高于iPSC和成纤维细胞或iPSC样对照。我们还发现，与成纤维细胞和cipsc样细胞相比，分化细胞中胶质标志物胶质成熟因子beta (GMFB)的表达显著增加。这表明，除了神经元外，一些鸡的ipsc样细胞可能在我们的神经元分化培养基中分化成胶质细胞。

接下来测试分化的细胞是否表现出神经元的膜兴奋性特征。我们在视觉控制下从培养的细胞中记录了全蜂窝录制，选择具有多极神经元形态的细胞（图8(一个))．在我们膜片箝位的4个细胞中，3个表现出强烈的动作电位。与神经元表型一致，分化细胞的静息膜电位在−68 ~−65 mV之间。然后我们以电流箝位模式注入去极化电流以评估动作电位触发的存在(图)8（b）)．这一过程持续地产生一系列超调动作电位，其诱发阈值约为- 40至- 33 mV，其高度为78至86 mV。峰值迅速(宽度在半最大值，1.5毫秒)，也显示明显的后超极化(图8（b）和8（c）)．超极化电流注入产生膜电位的分级变化，表明输入电阻为433megaohms。我们从显示出类似的烧制属性中记录的每个多极细胞。因此，分化的IPSC样细胞显示出若干电生理学特征，其指示神经元细胞类型。

4。讨论

我们的研究证明了一种有效的方法来产生和维持鸡的ipsc样细胞，并将它们分化成神经元。这一发现表明，之前让细胞通过少量传代进行增殖的困难并不一定是由于细胞是否是ips细胞，而是由于特定的培养基条件。然而，我们的结果也表明，培养基条件可以帮助细胞从潜在的部分增生状态过渡到一个更高度增殖的重编程状态。在改良的2i+禽类培养基中，我们的鸡诱导多能干细胞样细胞在传代过程中经历了三个不同的形态阶段:缓慢生长、有分化成纤维细胞的快速生长、很少成纤维细胞的快速生长。我们假设周围的成纤维细胞从ipsc样细胞分化，并帮助维持增殖的干细胞在早期阶段，正如某些人证明的那样[22鼠标esey线[23］．这很可能是为为维持人干细胞的方案受益于与成纤维细胞的细胞有益于细胞的原因22］．在这种情况下，人们认为，干细胞通过不对称分裂，创造了自己的利基分化喂养细胞，使干细胞进一步增殖。我们的鸡细胞在小鼠和鸡饲养细胞上缺乏生长，这表明自来源的鸡成纤维细胞可能产生特定的支持鸡干细胞的因子。总的来说，不同的阶段表明，在适当的条件下，iPSC的发展可以是一个渐进的过程。我们不知道老鼠和鸡之间的物种差异是否反映了哺乳动物和鸟类之间的差异，但一些初步结果表明，至少部分是这样的;我们从斑胸草雀(一种鸣禽)中生成的ips样细胞的持续实验表明，在我们改进的2i+中，斑胸草雀细胞的增殖能力比在任何其他介质中都要高(未发表的观察结果)。

我们在本文中遇到的一个主要发现是，当我们在培养基条件下减少近20倍的LIF时，细胞增殖能力增加。LIF被认为是一种反分化因子，它是干细胞维持其多能性所需要的，去除LIF会启动干细胞分化[24那25］．我们发现，当我们降低培养基中LIF的含量时，一些鸡的ipsc样细胞会分化并形成一个生态位，更多的干细胞会在上面进一步增殖。我们认为，这就是鸡类ipsc细胞转变成为完全永生的原因。同样，我们偏离了标准的3i培养基，将抑制FGF受体酪氨酸激酶的PD183452替换为抑制tgf - β的A83-01，发现这是一种令人愉快的替代鸡和小鼠ipsc样细胞[13］．通过用更有效的MEK抑制剂PD0325901替换PD184352，Ying等人。发现CHIR99021和PD184352的“2I”组合在维持多能小鼠ES细胞方面具有高效。丁和同事介绍了A83-01，TGF-kari，Alk4和Alk7的选择性抑制剂，产生大鼠和人IPSC，其自更新状态更接近小鼠ES细胞[26］．与小鼠ES和IPS细胞不同，2I培养基中的生长大鼠和人IPSC仍然导致分化，通过添加A83-01成功地预防。这意味着与小鼠表集干细胞不同，更像大鼠和人IPSCs，鸡IPSC样细胞需要活化，而不是抑制TGF-β/ Activin途径。

从鸡的ipsc样细胞中，我们能够在3个阶段重复产生产生动作电位的神经元，最后一个阶段需要14天成熟和功能活性。另一项与我们平行进行的研究[27能够将鹌鹑IPSC样细胞分化为具有神经元结构的细胞中，但如果这些细胞具有功能性并未测试。14天与晚期妊娠日老鼠或小鼠的原发性胚胎神经元等同于原发性胚胎神经元（在10到14天之间）体外使小鼠干细胞成为能够发出动作电位的神经元[15］．因此，最后阶段与出生后的神经元成熟相当;先前的阶段在妊娠期间是神经元前体发育。

5.结论

这项研究有助于一系列渐进的实验，表明创建非哺乳动物ips样细胞并控制其分化是可能的体外．禽IPSC样细胞进入神经元的分化为从移植到另一种物种移植到另一种物种中研究命运和神经元的功能的可能性。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

致谢

作者感谢Bertrand Pain和Marie-Cecile Van de Lavoir用于鸡胚的干细胞样本，讨论和某些媒体条件的协议，以及Duke病毒载体核心的Marguerita Klein，为高滴度的慢病毒制剂，Richard Mooney使用他的实验室和设备的电生理记录，Malavika Murugan提供录音，迈克尔·庞大人使用他的实验室空间，Natalia Alenina进行协议和讨论细胞增殖实验。他们还感谢一个匿名评论员，了解有关修饰2I培养基对鸡与小鼠细胞的疗效的解释的建议。该研究是在瑞戴本科荣誉研究论文中的部分履行。该项目由NIH董事先锋奖和Hhmi至Erich D.Jarvis，P30ns061789（UH）的资金支持，P30ns061789（UH），来自波多黎各医学科学校园（400100420002）和Duke本科研究支持办公室和Daad对瑞戴的支持。

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