真菌(alternaria.纳米银纳米粒子的合成、表征及抗真菌活性筛选

抽象的

科学共识现在正在开发一种生物控制剂，这可能导致对农业病原体的细胞代谢重编程。通过使用植物疗法真菌进行银纳米粒子的生物合成（alternaria.SP。）从香蕉栽培土壤隔离。alternaria.sp可以快速生长并产生足够高的生物活性化合物。本研究旨在利用真菌生物合成银纳米颗粒(AgNPs)alternaria.SP。代谢产物是一种安全的抗真菌药物的安全抗真菌剂（镰刀菌素SPP。和alternaria.sp)。为了可视化AgNPs的形成，使用了分析仪器，如紫外-可见(UV-Vis)光谱、傅里叶变换红外(FTIR)光谱、扫描透射电子显微镜(STEM)、能量色散x射线(EDX)和元素映射。紫外可见光谱在435 nm处有一个峰。扫描透射电子显微镜(STEM)分析表明，合成的银纳米颗粒尺寸在3 ~ 10 nm之间。所得的AgNPs对植物病原真菌具有明显的抗真菌活性。合成的AgNPs在抗真菌化合物对抗植物疾病方面已显示出显著的潜力。

1.介绍

应制备对人类和牲畜危害较小的生物防治剂[1］.目前，生物防治剂在商业水平上的使用存在一定的局限性，如对生物和非生物因素的适应性和预期活性之间的恶化在体外和体内[2］.现在是利用纳米技术开发更有效和非持久性生物农药的时候了，利用生物银、锌、铜、金和铁[3.］.

真菌毒性代谢物(抗生素和其他生物活性代谢物)被证明有助于农业中的生物防治应用[4.］.真菌可以在合适的条件下产生一定量的细胞外酶如几丁酶，葡聚糖酶，蛋白酶，糖基水解酶，木聚糖酶，纤维素酶和甘露糖酶[5.］.由于符合绿色化学的理想和概念，来自生物源的金属纳米颗粒受到了极大的关注[6.］.

随着技术进步使纳米银颗粒的加工更加经济，纳米银颗粒变得越来越受欢迎[7.］.已经进行了许多尝试，以合成来自氧化锌和硝酸银用于植物病原菌的有效管理的氧化氧化物和硝酸银的纳米抗真菌化合物，包括Fusarium oxysporum，青霉蛋白石那alternaria citri.那alternaria交替， 和Aspergillus尼日尔[8.那9.］.Kanhed et al.(2014)和Bramhanwade et al.(2016)也合成了对作物病害的植物病原真菌表现出强大的抗真菌活性的铜纳米颗粒。[10那11］.银的一种可能用途是控制植物病害。由于银对微生物表现出多种抑制作用模式[12]，它比合成杀菌剂使用相对安全[13］.Al-Zubaidi等人也显示出对植物植物致病性真菌的抗菌活性的疗效和广泛的抗微生物活性。（2019）[14］.然而，这项限制性研究到目前为止已经证明了银在管理植物病害方面的适用性[13］.

为了控制一些植物真菌疾病，已证明生物纳米颗粒是有效的纳米材料的杀真菌剂。因此，它们拥有农业广泛使用的潜力，作为促进可持续农业的生物管制剂[3.］.本研究旨在利用一种快速生长的真菌的代谢物合成环境友好的生物AgNPsalternaria.sp。有效控制一些植物疗法真菌。alternaria.在这项研究中，Sp .的提取物首次被使用，并被发现在将银离子还原成银纳米颗粒方面非常有效。利用真菌提取物合成金属NPs是制备植物病原生物防治药剂最有效、最环保的方法。

2.材料和方法

2.1。试剂和仪器

从阿拉丁，中国购买银盐（分析级）和培养基，在整个实验中使用的溶剂是双蒸馏水（DDH₂O）（Millipore 18.2 Mx cm）。本研究中使用的仪器是高速冷藏离心机（JW-3021HR），UV / VIS分光光度计（Shimadzu，UV-3600），扫描透射电子显微镜（Stem），能量分散X射线（EDX）（JEOL JEM-ARM200F 200 kV），Zeta电位（Horiba Zetasizer SZ100）和FTIR（Nicolet 6700 FTIR光谱仪）。

2.2。真菌分离，表征和代谢物的制备

alternaria.从严重枯萎病香蕉根际土壤中分离到sp.，方法如下:土壤样品采集于中国桂林。采用连续稀释法分离病原菌，置于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上培养，26-28℃孵育5 d。通过培养和显微形态鉴定纯化的培养物。内部转录间隔(ITS) rDNA序列分析证实了推测的鉴定。利用引物ITS1F (5 ' -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ')和ITS4 (5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')扩增真菌分离株的整个ITS区域[15］.结果扩增产物用3730 XL DNA分析仪测序(美国应用生物系统公司)。序列鉴定后存入NCBI、BLAST数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi?page=尼核苷酸）.它的登录号是MN096578。

alternaria.sp.(7日龄)在200 ml PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)中26-28°C培养5天。7000 rpm离心10 min回收生物质。倒出上清液，然后用消毒去离子水清洗生物质颗粒，以去除生长培养基的所有剩余成分。洗涤后，将生物质重悬于100ml灭菌的ddH中₂O，在28°C孵育3天，然后通过0.22过滤μ.M膜过滤器，得到小分子代谢物。所得滤液用于纳米银的合成[16］.

2.3。银纳米粒子的细胞外生物合成

用于制备AgNP，10毫升alternaria.SP。使用50ml 1mM硝酸盐（AgNo）处理的代谢滤液（Agno_3.）溶液并在室温下保持搅拌（500rpm）（25±1°C）[16］.在反应混合物中的红褐色的发展表示agnps的合成。通过UV可见光光谱（Shimadzu UV3600，Japan）鉴定了诸如AgNP的局部表面等离子体共振（LSPR）的光学性质。在SPR带饱和后终止反应。通过以12,000rpm离心15分钟，回收悬浮液中的所得产物。反复洗涤收集的AgNP并冷冻干燥。真菌介导的银纳米颗粒的绿色合成还用于表征它们的性质并检查它们对植物病变的抗真菌活性[17］.

2.4。银纳米粒子的表征

2.4.1。UV可见光谱分析

AgNPS检测主要通过视觉检查硝酸银后的真菌滤液颜色变化进行。黑褐色真菌细胞滤液的外观表明AgNPS形成。此外，使用UV-Vis吸收光谱进一步证实生物酰胺合成。通过UV可见光光谱（Shimadzu UV3600，Japan）鉴定了诸如AgNP的局部表面等离子体共振（LSPR）的光学性质。在SPR带饱和后终止反应。使用分光光度计（Shimadzu UV-3600，日本）在190-800nm的波长范围内测量样品的吸收光谱;DDH.₂o蒸馏水用作坯料。

2.4.2。扫描透射电子显微镜（Stem）和能量分散X射线（EDX）分析

为制备干燥的AgNPs粉末，将处理过的肉汤在12000 rpm离心15分钟。丢弃上清液，AgNPs颗粒用蒸压蒸馏水和冷冻干燥洗三次[16］.将干燥的AgNP分散并转移至具有少量NM厚碳膜的Cu 200目TEM网格，并在60℃下干燥24小时。使用JEOL JEM-ARM200F 200 kV杆进行分析AgNP。该仪器配备有100mm的灯元件²SDD EDS探测器。通过使用50nm的空间分辨率，通过选择区域的电子衍射获得矿物学信息和二维元素地图。通过SEM结果估计粒度并通过茎结果证实。

2.4.3。电动电势

为了测定上述制备的干燥AgNPs的表面电荷，使用Zetasizer (Zetasizer SZ-100, HORIBA)进行zeta电位测量[18］.

2.4.4。傅里叶变换红外（FTIR）

对上述制备的AgNPs冻干粉进行傅立叶变换红外光谱分析。采用400-4000 cm的FTIR光谱仪(Nicolet 6700, Thermo Scientific)测定制备材料(AgNPs)中的FTIR光谱波段^-1在透射模式中。使用溴化钾（KBR）颗粒技术制备用于FTIR分析的样品，这涉及在高压下形成颗粒之前用KBR彻底将AgNP与KBR混合。

2.5。植物病变集合

本研究中使用的植物病原真菌是alternaria.sp。Fusarium oxysporum那镰刀菌素moniliforme， 和镰刀菌素tricinctum。alternaria.sp。被隔离从香蕉脱菱泥土。后三是由北京石油大学重型石油加工国家重点实验室提供的，中国北京。根据制造商的说明，所有真菌在马铃薯右旋糖琼脂（PDA）上种植。Fusarium oxysporum出现为一个丰富的白色棉花菌落与白色空气菌丝。镰刀菌素moniliforme背面有黑色菌落，有白色气生和边缘菌丝。镰刀菌素tricinctum殖民地有丰富的棉花白菌丝体。

2.6。纳米银抗真菌潜力的筛选

井扩散方法用于评估生物合成的AgNP的抗真菌潜力对四种病原菌株（Fusarium oxysporum那镰刀菌素moniliforme那镰刀菌素tricinctum， 和alternaria.sp)。用PDA琼脂培养基制备培养皿，该PDA琼脂培养基，直径为8mm直径。接种后，井装有不同浓度（25,50和100 μ.l)从AgNPs原液(1 mg·ml)中提取^-1）.将板在28±1℃下孵育，并在5天后检查抑制区[19］.对抑制菌丝生长的方法进行比较，采用单因素方差分析，以确定活性的重要性。每个活动的显著差异由T.-测试 。

3.结果与讨论

３.１.纳米粒子的合成及紫外-可见光谱分析

alternaria.sp.被分离，并在平板上生长用于提取制备(图1（a））.真菌孢子的显微形态如图所示1（b）。系统发育树alternaria.sp。和相关物种基于自信地，其与邻近连接构建的序列在图中呈现1（c）。混合后alternaria.sp。用Agno提取_3.解决方案，目测指出，混合物的颜色从透明变为深棕色（图2）.由于银离子的还原和AgNPs的形成，颜色变成了深棕色[18］.在反应30分钟后，每隔一段时间记录颜色和吸光度的变化，因为颜色的变化是成功形成纳米颗粒的第一个证据。一般来说，颜色的变化是由于真菌提取物释放还原剂到溶液中[16］.紫外可见光谱也证实了这一点;当暴露在特定波长的光下时，NPs表现出一种独特的表面现象，称为表面等离子体共振(SPR);因此，通过紫外-可见光谱分析，每种NPs都有特定的峰形成[20.］.agnps的合成使用（alternaria.SP。）通过UV-Vis光谱监测提取物;在350-500nm的范围内观察到真菌生物质的光吸收图案。

SPR的银离子还原峰出现在435 nm处(图)3.）.其他研究人员还报道了435纳米的agnps相同的峰值区域;其中一个人使用用真菌生物量孵育Ag离子木霉属koningii[19］.光谱分析表明，对于在不改变峰值位置的函数时，通常观察到435nm的UV-vis SPR峰值通常观察到的AgNP，这是随时间的函数而增加的。它进一步证实银离子转化为银纳米颗粒。这次观察表明alternaria.sp.介导单分散AgNPs的生物成因形成。显然，金属纳米颗粒的SPR峰取决于颗粒的大小、形状和反应介质。SPR峰通常会随着颗粒尺寸的增大而出现红移[21］.在该研究中，SPR峰保持其光谱位置，确认均匀的粒度分布。真菌提取物富含生物活性分子和官能团，如-OH，酰胺和羧基，改善了AgNP的定量产生和它们的稳定分散[22］.因此，真菌提取物具有用于纳米颗粒的生物合成的动力。

我们以常规时间间隔测定反应样品的UV-Vis光谱，以研究反应时间的效果。最初，滤液的颜色是浅黄色。随着时间的推移，颜色转移到棕色，然后是深棕色，吸收压力增加，这表明滤液中的agnps连续合成（图3.）.在合成30天后进行稳定性评价，吸收峰值没有变化，说明纳米粒子在环境条件(28°C)下1个月后具有很高的稳定性。在单分散纳米粒子的情况下，只能得到一个等离子体带。强度的增加表明反应的递进程度随着粒子数目的相应增加[16］.

３．２．基于真菌合成AgNPs的特性研究

3.2.1。Zeta潜在分析

生物合成AgNPs的zeta电位分析发现，在−60到0 mV之间有一个尖峰，在−31.9 mV处有最大强度(图)4.）.这表明在介质中膨胀的AgNPs表面存在负电荷。粒子之间的斥力可能是由于负值，证明粒子是非常稳定的。低的zeta电位值表明没有絮凝作用，也没有由于粒子间的斥力而聚集的倾向[23那24］.

3.2.2。扫描透射电镜(STEM)分析

通过STEM分析揭示了生物合成AgNPs的形态和尺寸分布。制备的AgNPs呈球形形态(见图)5（a）和5 (b)）.生物agnps显示3-10 nm的粒度范围（图5 (c)）.还显而易见的是，生物分子在提取物中alternaria.sp。促进了AgNP的合成。来自不同提取物的其他研究人员报告的AGNP的SEM图像显示球形颗粒，聚集的球形颗粒，不规则形状的颗粒和立方粒子[16那25］.观察到的中等粒子的尺寸为5,12,25,35和50nm，用于通过使用水作为溶剂的不同生物提取物合成的agnps。其他研究人员还发现了类似的结果[16那25-28］.在一篇文章中，比较了这些方法的优缺点和纳米粒子在不同领域的应用，描述了合成不同形状和尺寸(从2到300 nm)的AgNPs的化学、物理和生物方法[29］.

3.2.3。能量分散X射线（EDX）分析

对AgNPs进行EDX，以研究生物合成AgNPs的元素组成(图)5 (d)）.EDX光谱显示出约3和3.1keV的银峰的存在，其由于分别从L和K银壳的不同电子排出而出现。因此，EDX图案清楚地表明AgNP在自然界中是结晶的。较低的能量峰（3keV）负责外壳电子（L），较高的能量峰（3.1keV）负责内壳电子（k）。该观察与Kasithevar等人的上一份报告一致。[27］.在光谱中出现的碳峰主要是由于使用了碳胶带，其余的峰可能是由于来自生物分子中的无机杂质alternaria.sp.提取。AgNPs的EDX数据显示，Ag的重量百分比为92%。这也与早些时候报道的结果一致[28］.

3.2.4。FTIR光谱分析

使用FTIR来量化和确定功能生物分子alternaria.这对将银离子还原成相对的银纳米颗粒很重要。的alternaria.sp。提取物具有各种生物分子，这可能参与这些agnps的合成（图6.）.在电磁光谱的IR区域出现许多突出的峰是由于不同的官能团。在3421厘米处观测到活动和延伸的波段^-1确认存在多酚-OH基团。相对于吸收带2870cm处的C-H伸展振动的烷基观察到第二带。^-1;第三个窄带发生在2815厘米处^-1属于烷烃基团的碳氢化合物。第四峰在1638厘米^-1表明酰胺I基团的存在;第5条短带出现在1450 cm处^-1赋于羧酸，而第6峰在1156厘米左右^-1是代表芳香环的延伸，第七条带在1027厘米^-1对应于蛋白质脂族胺的C-N拉伸振动。最后一个宽和短频段为470厘米^-1代表烷基卤化物。该研究还证明了蛋白质和氨基酸是主要成分并且具有结合金属的能力。显然，多糖，磺化化合物和酰胺键牢固地参与银离子的还原成纳米颗粒。存在于真菌提取物中的生物分子具有减少银离子并稳定NPS的双重功能[26那30.］.

3.3。AGNP的抗真菌潜力

采用井扩散法评估生物合成的AgNPs对四种植物病原真菌的抗真菌潜力(Fusarium oxysporum那F.Maniliforme.那f . tricinctum， 和alternaria.sp)。通过不同植物和微生物介导的绿色合成获得agnps抗真菌活性的最新研究[19那31那32]，主要通过琼脂孔扩散方法进行评估。这与我们的研究结果一致，并显示了代表抗真菌作用的可比值。使用具有8mm直径的PDA培养基制备十二型培养皿，其直径为相等的距离。接种后，井装有不同浓度（25,50和100 μ.l）来自agnps的储备溶液（1 mg·ml^-1）.将板在28±1℃下孵育，5天后，测量抑制区（图7.）.桌子1总结了对四种植物病变的AgNP的抑制区直径。

AgNPs的最低抑菌浓度(MIC)为25μ.L，而50和100时，所有菌株的生长速度都很低μ.l.以抑制带直径为分值，说明抑制带直径随AgNPs浓度的增加而增大。在25、50和100时，抑制带的平均直径分别为14.7±1.5 mm、17±2 mm和21.3±1 mmμ.l分别为Fusarium oxysporum（数字7.（一种））。抑制区镰刀菌素moniliforme测量为9±2 mm，11.3±1.5毫米，25,50和100的17.5±1.3毫米 μ.l分别浓度agnps（图7.(b))。抑制区镰刀菌素tricinctum为11±2 mm，11.5±1.3 mm，21.2±1毫米，25,50和100 μ.l分别浓度agnps（图7.(c))。为alternaria.SP。，抑制区的平均直径为17.1±1.02 mm，19.5±1.5 mm，25,50和100的21.6±1.5 mm μ.l分别（图7.（d））。在100时观察到最大抑制区 μ.l浓度AgNPSalternaria.sp。（21.6±1.5 mm）以下Fusarium oxysporum(21.3±1 mm)，表明生物合成的NPs对植物病原真菌菌株有一定的抑制作用。Birla et al.(2013)对比研究了这两种化学物质AgNO的抗菌活性_3.和生物生成的agnp;通过生物生物agnps观察到致病性真菌的较高抑制区直径值[16］.发现抑制区随着agnps的浓度增加而增加。这可能是由于高溶液密度，这可能使真菌菌丝饱和和粘合地钝化[32］.它还假定Ag⁺主要影响膜结合酶的功能，如呼吸链的功能，导致细胞完整性和渗透平衡的丧失，导致急性细胞毒性[33-35］.本研究中观察到的抗真菌活性可能是由于膜完整性的破坏。根据以前的研究，这是因为AGNP与细胞表面结合和锚定。这种相互作用导致结构性变化和显着破坏必要细胞功能的结构变化和损伤，使磁性和间隙抑制呼吸链酶活性，并最终导致细胞死亡[36-38］.总之，AgNPS对测试真菌的强烈抗真菌效应表现出强烈的抗真菌作用，可能是通过破坏膜的完整性;因此，得出结论，AgNP具有相当大的抗真菌活性，这需要进一步调查现场应用。为了得出结论，AgNPS显示出强烈的抗真菌效应，可能通过破坏膜完整性，在真菌上进行测试;因此，假设AgNP具有显着的抗真菌活性，需要进一步研究临床应用。

4.结论

纳米粒子的绿色还原和生物合成是一种有效、低成本、可持续和环境友好的方法。的植物alternaria.SP。在本研究中首次使用的提取物，并发现在将银离子还原成银纳米粒子的情况下非常有效。与早期的各种生物提取物相比，其他地方alternaria.sp.被发现在银还原中更有效，因为用这种提取物处理得到的NPs具有最低的zeta电位(−31.9 mV)。此外，利用真菌介导的AgNPs作为有效的生物防治剂抑制各种真菌植物病原。在100℃时，最大抑制带分别为21.6±1.5 mm和21.3±1.0 mmμ.l浓度AgNPSFusarium oxysporum和alternaria.sp。分别。这表明生物合成的NP对真菌植物病变的疗效。结论是，真菌提取物的金属NPS合成是制备植物病变抑制的生物控制剂的最有效和环保的方法。合成的参数和体内应在未来仔细研究抗真菌活动，以利用来自AGNP的全部潜力alternaria.SP。的代谢物，它表明自己是一种可以控制植物病变的可能的抗真菌剂。

数据可用性

没有数据用于支持这项研究。

利益冲突

作者声明他们在本文中没有利益冲突。

致谢

TTW和PCF感恩于中国海南大学的研究初创资金的财务支持（KYQD_ZR2017212）。SK非常感谢Shaheed Benazir Bhutto University，巴基斯坦的支持。

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