有机Nanovesicular货物的持续释放药物的合成，囊泡的形成，控制“采珠”的国家，和特装/释放研究

抽象的

“持续药物输送系统”是纳米医学领域的一个具有挑战性的课题，其设计目的是实现持久的治疗效果。我们开发了一种创新的策略来制备无毒和聚合物稳定的有机纳米泡(直径:200 nm)，从一个新的玻拉两亲，其中两个氢键乙酰胞嘧啶分子通过两个灵活的辛烷链连接到2,6-双吡唑吡啶的4,4”位置。纳米囊泡的行为类似于生物膜，它们自发地组装成“珍珠状”链，随后形成长纳米管(直径为150纳米)，并通过自组织进一步发展成各种类型的网络连接。在载药和给药应用中，纳米囊泡被生物相容的聚乙二醇-2000保护，以防止它们融合和随后的管形成。通过斑马鱼致畸试验证明了纳米囊泡的无毒性质。生物相容性纳米囊泡装载了“特非那定”药物，并成功地在斑马鱼幼虫体内以持续(长达72小时)的方式运输和释放药物，这被认为是一种新兴的体内模型系统。

1.介绍

合成纳米/微观囊泡具有很大的兴趣，因为它们模拟了生物细胞膜的复杂性能[1- - - - - -4］．大多数生物膜是柔性的;因此，它们示出了多维形状变换以形成零维（0d）微球，一维（1D）汽缸和长柔性管状结构。因此，通过聚合物，肽或基于树枝状聚合物的合成囊泡来模仿天然存在的囊泡的性质是非常令人兴趣的，因为它们是纳米胺，生物传感器和生物物理和生物电子应用的潜在工具5- - - - - -8］．例如，在纳米胺的萌芽面积中，无毒囊泡充当微小球形容器，用于储存和递送生化反应中的化学品/试剂。Nanodrug递送系统保护药物免于降解，并在特定位点递送药物，从而提高治疗的疗效[5，9，10］．有时，由于许多囊泡膜之间的表面分子的相互作用，多个囊泡熔丝，称为“珠氏”的现象，这导致形成纳米囊泡（NTV）[11］．合成NTVs也提出了囊泡之间的化学品的运输。能够模仿生物膜的无毒仿生分子因此合成实验室是一项艰巨的任务，因为它们可以作为救命的药物输送和药物缓释货物采取行动。虽然基于嵌段共聚物囊泡过多被探索用于药物递送应用[5而由受生物学启发的小分子产生的囊泡则非常罕见。早先我们已经发现，与长烷基连接的芳香族刚性核2,6-双吡唑吡啶(BPP)形成囊泡[12］．因此，在药物加载应用中，用DNA和RNA中的碱基对之一装饰的刚性分子是实现无毒药物传递系统的一个很有前景的起点。软囊泡的一个主要问题是它们倾向于通过熔合机制形成管状。

在本文中，我们展示了我们的策略，以从新的博拉哌啶中制备无毒和聚合物稳定的囊泡1，即两个氢键n4 -乙酰胞嘧啶分子使用两条柔性辛烷链连接到BPP的4,4”位。该囊泡装载特非那定药物，并成功用于斑马鱼幼虫体内的药物运输和释放，是一种新兴的体内模型系统(图)1）.在本文中，我们提出了1通过保护纳米粒子（NV）与生物相容性PEG 2000，三苯胺（TFN）药物负载及其持续的药物释放趋势来防止融合驱动纳米管形成。使用扫描电子显微镜（SEM），透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）进行彻底表征纳米粒子。

2。材料和方法

2.1。合成化合物1

分子1在BPP（方案）中以六个步骤合成1）;化合物2根据我们报告的程序合成[13，14］．

10、10”- （1,1.”- （吡啶-2,6-二基）双（1H-吡唑-4,1-二基））双（DEC-9-YN-1-OL）（3）．复合2（0.5g，1.07 mmol），PD（PPH_3.）₂CL.₂（0.075g，0.106mmol），pph_3.（0.050g，0.214mmol），崔（0.027g，0.144mmol）在100ml双圆形底部烧瓶中取出。向该固体混合物中，通过冷凝器施加高真空以进行脱氧。随后，将溶剂干三乙胺（15mL），1,4二恶烷（3mL）加入到N下的脱氧固体混合物中₂大气层。5分钟后，加入9-Dec-YN-1-OL（0.217g，1.41mmol）并在n下搅拌8小时₂80°C的气氛。在减压下除去溶剂，并通过5％甲醇/ DCM通过柱色谱纯化固体产物。用乙醚洗涤化合物后，纯净3.得到白色固体（80％收率）。¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）：δ.= 8.6 (2 h), 7.9 (m, 1 h), 7.8 (d, 2 h), 7.7 (s, 2小时),3.6 (m, 2 h,哟₂)、2.4 (m, 4H)、1.6 (m, 12H)、1.4 (m, 12H) ppm。¹³C-NMR（100 MHz，CDCL_3.）：δ.= 149.4, 144.6, 141.5, 129.0, 109.5, 106.5, 92.6, 70.6, 62.9, 32.7, 31.9, 29.7, 29.2, 28.8, 25.7, 22.6, 19.4 ppm. FT-IR (KBr): 3616.86, 3398.88, 3146.18, 3055.52, 2928.21, 2851.05, 1726.45, 1601.06, 1481.46, 1497.1, 1402.38, 1354.15, 1265.42, 1219.12, 1186.33, 1055.16, 1028.15, 972.21, 952.92, 896.98, 864.19, 800.53, 738.80, 706.01, 655.86. LC-MS analysism / z.：实验值= 515.0，计算值= 514.2。肛交。计算的。对于C_31.H_41.N₅O₂: C, 72.20;H, 8.01;N, 13.58; C, 72.36;H, 8.12;13.49 N,。

10、10”- （1,1.”——(Pyridine-2 6-diyl) bis (1 h-pyrazole-4 1-diyl)) bis (dec-9-yne-10 1-diyl) bis (4-methylbenzene-sulfonate)（4）．对悬浮液3.（0.3g，0.58mmol）在DCM（15mL）和网中_3.（5mL），缓慢加入氯乙烯（0.443g，2.32mmol）。将反应混合物在室温下搅拌2小时。所有溶剂在减压下蒸发，并通过与EtOAc /己烷（2：8）柱色谱纯化粗产物。无色固体化合物4获得75％的产率。¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）：δ.= 8.5（s，2h），7.9（m，1h），7.8（s，4h），7.7（s，2h），7.7（s，2h），7.3（m，4h），4.0（m，2h， -och.₂), 2.4(年代,6 h), 2.35 (m, 4 h), 1.6 (m, 8 h), 1.5 (m, 4 h), 1.4 (m, 4 h), 1.2 ppm (m, 12 h)。¹³C-NMR（100 MHz，CDCL_3.）：δ.= 149.4, 144.6, 141.5, 133.2, 129.8, 128.9, 127.8, 109.6, 106.5, 92.5, 70.6, 28.9, 28.6, 25.3, 21.6, 19.4 ppm. FT-IR (KBr): 3483, 3148, 3109, 3055, 2932, 2856, 1718, 1604, 1469, 1398, 1358, 1288, 1219, 1176, 1099, 1024, 951, 806, 777, 731, 661. LC-MS analysism / z.:实验值= 684.6，计算值= 683.8。肛交。计算的。对于C_45.H_53.N₅O₆年代₂：C，65.59;H，6.48;N，8.50发现：C，65.48;H，6.42;n，8.61。

(2, 6-Bis (4) - 10-bromodec-1-ynyl 1 h-pyrazol-1-yl)吡啶（5）．到悬浮的化合物溶液4（0.20g，0.242mmol）在干燥丙酮锂溴化锂（0.0842g，0.970mmol）中。在室温下搅拌2小时后，减压蒸发丙酮，用DCM萃取水中的水和粗化合物。蒸发DCM后，化合物5得到白色固体（产率89％）。¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）：δ.= 8.5（s，2h），7.9（m，1h），7.8（d，2h），7.7（s，2h），3.4（m，2h，-brch₂），2.4（m，4h），1.9（m，4h），1.5（m，4h），1.4（m，8h），1.3（m，8h）ppm。¹³C-NMR（100 MHz，CDCL_3.）：δ.= 149.4,144.6,141.5,129.0,109.5,106.5,92.5,70.7,34.0,32.7,28.9,28.8,26.4,19.4 ppm。FT-IR（KBR）：3437,2924,2854,1720,1651,1599,1481,1390,1101,1014,954,800.LC-MS分析m / z.:实验值= 502，计算值= 501.2。肛交。计算的。对于C_31.H_39.布尔₂N₅：C，58.04;H，6.13;N，10.92发现：C，58.12;H，6.17;n，24.87。

n，n”- （1,1.”- （10,10.”- （1,1.”- （吡啶-2,6-二基）二（1H-吡唑-4,1-二基））双（癸-9-炔10,1二基））双（2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4,1-二基））二乙酰胺（1）．在100mL圆底烧瓶中取出干燥DMF（15mL）中的N4-乙酰基胞嘧啶（0.333g，1.404mmol）。K.₂有限公司_3.加入0.258 g, 1.814 mmol，使n -乙酰胞嘧啶转化为盐。在室温下搅拌约15分钟后，复合5加入（0.3g，0.468mmol）并在80℃下加热至回流16小时。减压除去DMF，将粗产物重新分散在水中并用氯仿萃取。用0.1M HCl（20mL）和饱和NaCl溶液（10mL）洗涤有机级分。复合1在液体形式蒸发氯仿后获得并通过硅胶柱色谱法纯化，用5％甲醇/ DCM纯化。纯化合物1为白色固体，收率为55%。¹H-NMR (400 MHz, CDCl ._3.）：δ.= 10.4 (nh), 8.5 (s, 2小时),7.9 (m, 1 h), 7.8 (d, 2 h), 7.7 (s, 2小时),7.6 (d, 1 h), 7.4 (d, 1 h), 3.8 (m, 2 h, -NCH₂），2.4（m，4h），2.3（s，6h），1.7（m，4h），1.5（m，4h），1.4（m，16h）ppm。¹³C-NMR（100 MHz，CDCL_3.）：δ.= 171.3,162.8,155.7,149.4,148.8,144.6,141.5,129.0,109.5,106.9,96.7,92.5,70.6,51.1,36.5,31.4,29.7,28.9,21.4,24.8,21.2,26.4,24.8,21.2,19.4 ppm。FT-IR（KBR）：3325,3136,2926,2852,1697,1662,1556,1479,1429,1381,1307,1219,1178,1028,952,866,800,655,617 .LC-MS分析m / z.：实验值= 646.0，计算值= 645.2。肛交。计算的。对于C_43.H_51.N₁₁O₄：C，65.71;H，6.54;n，19.60找到：C，65.86;H，6.51;n，19.51。

2.2。制备Nanovesicles

PEG-400稳定纳米囊泡的合成。复合1（将0.5mg，0.00063mmol）溶于0.5ml DMSO中，并在50ml去离子水中快速注射搅拌，含有预先溶解的PEG-400（0.6g，0.0003mmol）。在室温下搅拌5分钟后，将溶液在二氧化硅上浇铸，并通过TEM，AFM和微拉曼光谱分析。在室温下搅拌剩余溶液120小时，并收集样品并每24小时分析。

PEG-2000稳定的纳米粒子合成。如上所述进行实验;使用PEG-2000代替PEG-400。

的TFN，加载合成稳定的纳米囊泡。通过将2mg TFN溶解在1ml去离子水中来制备三苯胺（TFN）的储备溶液。1（0.5 mg, 0.00063 mmol) was dissolved in 0.45 mL of DMSO, mixed with 0.05 mL of TFN stock solution, and rapidly injected at vigorous stirring in 50 mL of deionized water, containing predissolved PEG-2000 (0.6 g, 0.0003 mmol). After 12 h of stirring at RT solution was filtered through syringe with hydrophilic syringe filter (Millipore, pores size 0.45 μ.用于除去过量的TFN和PEG-2000的M，亲水，PVDF，然后用去离子水洗涤囊泡，并将最终体积调节至10mL（溶液V1-TFN）。该溶液用于鉴定囊泡中TFN的浓度，药物负载囊泡的稳定性以及斑马鱼研究。另见实验的示意图（图2和3.）.

2.3。纳米粒子的特征

通过扫描电子显微镜（SEM），原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）检查纳米结构的尺寸和形态。使用飞利浦XL30 ESEM扫描电子显微镜进行SEM研究，该光束电压为20kV。在20 kV的日立S-4500 SE / N仪器上进行FESEM测量。使用TECNAI G2 FEI F12透射电子显微镜（TEM）在加速电压为200kV时完成TEM研究。碳涂层TEM网格（200目，B）购自TED Pella Inc.美国。使用650nm波长的2R激光器在NT-MDT模型求解器PRO M显微镜上进行原子力显微镜（AFM）成像，其650nm波长为650nm波长，最大输出为1mW。所有计算和图像处理都由制造商提供的软件Nova 1.0.26.1443进行。使用从NT-MDT，莫斯科购买的非接触式超锋利硅悬臂（NSG 10_DLC）金刚石以非接触式超锋利的硅悬臂（NSG 10_DLC）金刚石以半切换模式记录图像。尖端的尺寸如下：悬臂长度= 100（±5） μ.m，悬臂宽35（±5） μ.M，悬臂厚度= 1.7-2.3 μ.m;共振频率= 190 - 325khz;力常数= 5.5-22.5 N/m;芯片尺寸= 3.6 × 1.6 × 0.4 mm;反射面= Au;尖端高度= 10-20μ.m;DLC尖端曲率半径= 1-3 nm。

AFM，LCFM，SEM，FESEM和TEM样品准备。通过用于AFM研究的毛细管在清洁玻璃载体上浇注两滴样品溶液。将两滴样品溶液浇注在碳涂覆的铜网（200目）上，具有不同的时间间隔，用于纳米结构的TEM研究。

载有吸毒囊泡研究的稳定性。溶液V1-TFN在室温下搅拌左右搅拌120小时，并收集样品并每24小时分析，以识别纳米粒子崩解的时间点。

确定周围媒体中TFN浓度的测定（图3.）.在下面描述的过程中，研究了由纳米粒子泄漏产生的溶液中的TFN浓度：收集1ml溶液V1-TFN，通过亲水注射器过滤过滤，用1ml去离子水洗涤1次。用二异丙醚从滤液中提取TFN;蒸发溶剂，将剩余的TFN重新溶于2ml乙腈中。根据修饰的公布程序测量该溶液中TFN的浓度[15，16］．将乙腈（2mL）中的TFN溶液与2mL DDQ溶液（5mg / mL）混合。产生有色物质，并立即在457nm处测定吸光度强度，与校准图相比，通过绘制形成的CT复合物的吸光度与药物的最终浓度相比（μ.g / ml）。本研究对每24小时至120小时收集的样本进行重复。

纳米粒子内TFN浓度的测定（图3.）.Concentrations of TFN inside vesicles at different time points were investigated following procedure described below: 1 mL of solution V1-TFN was collected, filtered through hydrophilic syringe filter, and washed 1 time with 1 mL of deionized water to remove excess of the drug and PEG-2000, and residue was redispersed in 2 mL of water and subjected to sonication for 30 min at RT to break down all vesicles and release TFN. The ability of ultrasound to induce localized and controlled drug release from liposomes, synthetic diblock copolymers, and polymersomes is well known phenomena [17，18］．接下来，用大量的二异丙醚从该溶液中提取TFN;蒸发溶剂，将剩余的TFN重新溶于2ml乙腈中。用ACN替代溶剂是必要的，因为它在其他溶剂上显示出用于形成CT复合物的超级优先级，同时促进从供体到受体的电荷转移。然后在选定的吸收最大（457nm）下测量ACN中TFN溶液的吸光度强度，并将获得的值与使用TFN溶液获得的校准曲线值进行比较：已知浓度的DDQ复合物（另见图9和10）.应用啤酒兰伯特法的TFN浓度为37.5 μ.M，允许我们使用以下等式找出药物加载效率： 在哪里是解决方案中TFN的初始浓度，而为装载后囊泡内TFN的浓度。本研究对每24小时至120小时收集的样本进行重复。

2.4。斑马鱼研究

斑马鱼致畸性评估。通过先前描述的方法进行斑马鱼维护，繁殖和胚胎集合[19，20.］．简而言之，野生型成人斑马鱼（5-6个月大）在14：10 H光线下保持在28°C下保持在28°C。在刺激光照的情况下，允许鱼类繁殖（以2个女性：3个男性的比例）繁殖。将胚胎收集到含胚胎介质的甲状腺细胞中，并在28℃温度下温育。使用6胚胎进行致畸性研究，其与载体，阳性对照和各种浓度的测试化合物一起温育1直到5 dpf. The embryos were then anesthetized using 0.008% tricaine solution and various phenotypic parameters were evaluated; namely, body shape, somites, notochord, tail, intestine, fins, brain, upper jaw, heart, lower jaw, liver, and swim bladder were observed for defects in morphology [21.］．根据他们的毒性水平从5个中毒和0.5毒性的毒性等级得分。评分由盲目观察员进行，并根据前面描述的程序进行了[22.］．

载tfn纳米囊泡治疗斑马鱼的方案。对于TFN-NV评估，3种DPF（施肥后的施用日）幼虫分布在24孔板中，以及250 μ.0.1% DMSO溶液。每孔6个不同处理的胚，分别在24 h、48 h和72 h观察幼虫。然后用不同浓度的TFN微泡处理胚胎(5μ.M，10 μ.M，20 μ.m，和40岁 μ.m）。单独TFN在20 μ.M个浓度被用作阳性对照和0.1％DMSO用作阴性对照。将胚在24孔板中温育，并在处理后的不同的时间点观察到的心房和心室率。观察死亡率产生的TFN的影响了所有的胚胎。斑马鱼胚胎毒性试验结果汇总表1．

3.结果与讨论

3．1.化合物的合成与表征1

分子1在BPP（方案）中以六个步骤合成1）.4,4'碘化 - 合成BPP的位置2根据我们报告的程序进行了[13，14］．“接头分子”Decyn-1-OL的附着2通过采用sonogashira交叉耦合条件来实现3.产量高(80%)。复合3.在二乙胺作为碱存在的DCM溶剂中托索大化，得到4以75％的产率。复合5在治疗后，以优异的产量（89％）制备4在丙酮中与溴化锂反应。目标bolaamphiphile1通过治疗以55％的产率获得连接到疏水性烷基链的水溶性端基5用N4-乙酰胞嘧啶在碳酸钾存在下在80℃下存在。可变温度¹H-NMR研究1在cdcl._3.在减少温度时显示胞嘧啶-NH-组的清晰落下的近场化学偏移（补充信息图S1在线提供http://dx.doi.org/10.1155/2014/369139.）.这一观察表明胞嘧啶分子间的H键相互作用。此外，向DMF溶液缓慢加水(10^-3m）1在UV滴定期间显示出明显的蓝色偏移，指示其J-聚合行为。

3.2。纳米结构形成的研究

为了研究聚集驱动的纳米结构形成，含有2mg化合物的溶液1制备DMF（12mL）/水（6mL）并稳定一小时。将该溶液施放在二氧化硅上，然后进行SEM分析显示形成几微米的纤维网络的形成（图4）.解开纳米纤维网络组件的形成机制，相同的溶液1在碳涂层TEM网格上立即被抛出，立即缩小。有趣的是，TEM显微照片显示出尺寸的小囊泡在〜200nm的范围内（图5（a））和some aggregated pearl-chain linked vesicles of size in the range of ~150 nm (Figure5 (b)）.此外，囊泡融合产生的1D珍珠链状组装表明纳米管网络的形成(图)5 (c)和5 (d)）.为了进一步验证球形囊泡与纳米管在二氧化硅表面的融合，进行了原子力显微镜研究。AFM形貌清晰地显示了尺寸~200 nm的纳米囊泡(NVs)的存在(图)6(一)和6(b))。有趣的是，一些样品显示了自发形成的珍珠链状囊泡组合或纳米管集成囊泡，指出囊泡融合。每1μ.M链长CA.找到5个熔体囊泡，与囊泡的平均直径相匹配（图6（c）和6（d））。连续AFM测量揭示了由于分子重组引起的珠子链中直径〜160nm的平滑纳米管结构的演变（图6（e）和6(f))。在1D管形成过程中，由于熔合囊泡的拉伸，最终形成的囊泡直径(~160 nm)小于单个孤立囊泡的初始囊泡直径(~200 nm)。管的直径是由表面张力和管的弯曲刚度之间的平衡决定的，防止膜塌陷。管的外表面非常光滑，粗糙度小于1纳米(图)6（g）和6（H））。这结果证明了所提出的合成膜的灵活性1．另一个有趣的发现纳米管是通过自组织形成各种类型的网络连接的趋势（图6（e），插入）。

3.3。使用稳定剂控制纳米结构

为了证明用于药物递送的NVS应用中，在第一步骤中，不同的条件进行了筛选，以稳定在溶液状态囊泡和防止形成管状结构。我们意在使用聚乙二醇（PEG）作为稳定剂，因为它是生物学中性并且此外FDA批准的阱适合于药物应用[生物相容的聚合物23.］．使用PEG-400和PEG-2000用于稳定纳米粒子。在典型的方法中，化合物的DMSO溶液1（在0.5ml中0.5mg）在剧烈搅拌下在剧烈搅拌下将0.5mL的含有PEG（0.6g在50ml）的去离子水中进行剧烈搅拌5分钟。NVS与较低分子量（PEG-400）的聚合物PEG化并未表现出高稳定性;然而，使用PEG-2000稳定囊泡，较高至108小时。即使在那个时间点，也要大量的囊泡保留它们的结构，尽管它们的表面并不像24和48小时一样光滑。NVS的尺寸分布在<60nm至130nm的范围内;也观察到更大的囊泡（〜250nm）的微不足道（图7（a）和7（b））.

3．4．用斑马鱼致畸试验研究稳定纳米囊泡的毒性

对于基于NVs的药物传递研究，选择斑马鱼作为模型生物，因为它易于维持，相对便宜，给出快速的结果，是一个很好的预测化学品的有效性和安全性[24.，25.］．为了探索化合物的毒性1进行斑马鱼致畸试验。对24 hpf(受精后数小时)的胚胎进行处理1在不同的浓度和研究其生长和发育5天显示没有异常（图8和表1）.数字5代表所有参数不同治疗组的平均病变得分。该实验证实了无毒的性质1在所有的测试浓度。

3.5。Terfenadine装入纳米粒子

对于药物递送研究，选择了一种众所周知的抗组胺药三丁胺（TFN）作为模型药物。还已知TFN在斑马鱼中影响心跳规律，导致心动过缓，房室堵塞，最终死亡在不到12小时的情况下[26.］．这种药物的选择通过观察治疗后不同时间点的死亡率的终点来易于监测其对斑马鱼的影响。作为无毒的性质1在斑马鱼致畸性测定中已经测试，斑马鱼的任何死亡率仅归因于TFN的影响。此外，该过程简单，快速，无侵入性的药物作用的方法。制备药物包封的纳米粒子，TFN和化合物1在DMSO中溶解并在剧烈搅拌下在水中迅速注入PEG-2000的溶液中。将药物包封的纳米粒子溶液溶液留下12小时以进行老化，所以将所得溶液牺牲溶液研究TFN加载效率和纳米粒子稳定性。

生物样品中TFN浓度的测定是一种具有挑战性的分析任务。光谱法的直接施加（例如，测量UV吸收和荧光发射的强度）不适用于获得的值和药物含量之间没有相关性。大多数当前报道的方法（例如，HPLC或NMR）缺乏敏感性，以测量10以下浓度的药物水平 μ.克/毫升(15，16］．因此，选择基于2,3-二氯-5,6-二氰-1,4-苯醌（DDQ）的TFN电荷转移（CT）反应的分光光度法测定方法[15］．这种技术是最简单，快速，准确的方法之一，直到现在。在该方法中，TFN充当N-Electron供体，其在与强度的自发反应时形成高色电荷转移（CT）复合物-Acceptor DDQ。为了实施该程序并找出囊泡中载有较少量的药物，我们开发了内部协议（图3.，9， 和10）.用该方法计算囊泡内载药效率为~35±1%。进一步，为了证明囊泡没有随时间向周围介质泄漏药物，我们进行了稳定性控制实验:在RT至120 h时轻轻搅拌载药囊泡，每24 h采集一次样品，检测囊泡内和母液(超声前收集的溶液)中每个时间点的TFN浓度，如图所示3.．实验表明，没有大约72小时的主要泄漏（图11）培养基中TFN的浓度仍然低于10 μ.M，这是斑马鱼的敏感阈值(低于此浓度的TFN不影响鱼的发育和心跳)。72 h后，母液中TFN浓度突然升高，超过10μ.M.同时，在72小时后，NVS内部的TFN浓度显着降低。我们假设PEG涂层缓慢溶解导致NVS和突发的药物释放的变形（图6， 卡通片）。这些数据与在不同时间点的囊泡中记录的TEM数据相关联。图12（a）和12（b）分别为24和72 h时囊泡的TEM图像。在24h时，NVs具有良好的结构明确的形状(图12（a）），而72小时，我们观察到NVS的降解和NVS量的降低（图12（b））.这解释了72小时后的药物突发释放，在纳米/微球或纳米/微泡系统的情况下常见的效果[27.，28.］．

3.6。在斑马鱼幼虫中持续的TFN纳米寡核苷酸的药物递送

在四种不同浓度下用TFN加载的纳米粒子（TFN-NV）处理斑马鱼幼虫（5 μ.M，10 μ.M，20 μ.m，和40岁 μ.TFN的m），在24小时，48小时和72小时的时间点观察，以研究药物治疗后TFN引起的死亡率（图13）.TFN单独浓度为20 μ.m被用作阳性对照。观察结果表明，所有幼虫在阳性对照中（单独TFN，20 μ.m）在12小时内死亡。对于低浓度暴露于TFN-NV的幼虫（5-10 μ.m）在24小时观察到第一个死亡率（和因此药物效应），所有鱼在48小时内死亡。仍然观察到20次进一步的延长效果 μ.M;从24小时开始，死亡率慢慢增加，并且只有72小时检测到完全死亡率。

No cases of death were observed for larvae treated with the highest drug concentration up to 48 h, but all of them were dead at 72 h time point. The explanation of this aberration at highest concentration can be based on the fact that the TFN-NV at 40 μ.m形式聚集体（图14)，因此可能不会进入斑马鱼幼体的体循环;然而，到72小时时，TFN- nv将释放所有TFN，导致晚期死亡。囊泡稳定性研究和透射电镜数据(图11，12， 和14）支持这一解释。除此之外，我们观察到纳米粒子的沉淀到40 μ.m解决方案如果留下未受干扰。在其他浓度中看到的延迟死亡率是从体内持续/延迟释放TFN的TFN，其可以通过改变纳米粒子浓度来控制。由于我们没有观察到药物的主要泄漏来自纳米粒子，高达72小时（母液中的药物浓度低于斑马鱼敏感性阈值），我们得出结论，只有在药物内部释放后，才能观察到72小时低于72小时的效果斑马鱼生物体。

4。结论

作为药物递送货物的无毒和聚合物稳定的有机纳米粒子由用胞嘧啶部分装饰的新型BioInspired 2,6-双吡唑基吡啶衍生物制备。研究了纳米粒子的自发自组装成“珠光”链和随后的融合到纳米管中，并开发了方案以防止珠珠通过保护纳米寡核，用生物相容性PEG-2000保护纳米粒子。此外，囊泡加载三丁胺药物，并成功地用于运输到斑马鱼幼虫中，并以持续的方式释放药物高达72小时。尽管聚合物或嵌段共聚物的囊泡被广泛探索用于药物递送应用，但纳米粒子由小生物透露有机分子首次用于药物递送。我们证明，通过改变纳米粒子浓度，可以控制所需时间点的体内TFN释放。体内药物释放的机制是单独研究的主题。然而，目前的实验无疑证明了纳米粒子施用作为缓释药物递送系统的可能性。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

作者的贡献

Ajay Kumar Botcha和Balakrishna dulla同样为这项工作做出了贡献。

致谢

这项工作得到了DST（FAST TRACE SPEMENT NO.SR / FT / CS-083/2009），新德里支持。AKB和Err感谢SRFS的CSIR-New Delhi。

补充材料

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