JNK信号转导通路禁止显示LPS介导的通过上调NGAL HK-2细胞凋亡

摘要

客观的。探讨c-Jun n末端激酶(JNK)信号通路在NGAL表达上调中的作用及其在脂多糖(LPS)介导的肾小管上皮细胞损伤中的抗凋亡机制。方法。在体外，根据LPS时间将HK-2细胞分为5组(Con、LPS 1 h、LPS 3 h、LPS 6 h和LPS 12 h组)(10μ米)治疗。RT-PCR检测NGAL和caspase-3基因表达水平，评估动态变化。用SP600125预处理HK-2细胞(20)μM)， 2小时后再注射LPS (10μ刺激3小时。检测NGAL和caspase-3基因表达水平。结果。NGAL mRNA的6小时内显著增加，和caspase-3的mRNA在3小时内治疗后（增加的 )。相关分析显示其表达高度相关(r= 0.448, )。SP600125预处理后，LPS组NGAL mRNA表达受到抑制，caspase-3 mRNA表达显著增加。与LPS组相比，SB + LPS组NGAL mRNA表达水平明显降低，但略高于SP组(约为Con组的1.5倍)。而SB + LPS组caspase-3 mRNA表达明显升高( )(Con组的3.5倍)它还与SP和LPS组相比，表现出显著上升（与SB基;与LPS组)。我们还发现，与LPS组和SP + LPS组相比，NGAL和caspase 3蛋白显著升高，但SP600125使SP + LPS组NGAL蛋白水平降低了近35%，caspase 3蛋白水平升高了50% ( )。结论。JNK信号通路通过上调NGAL抑制lps介导的肾小管上皮细胞凋亡。

1.介绍

中性粒细胞明胶酶相关脂calin (NGAL)是一种在正常生理条件下极低表达的多功能蛋白。但当机体受损时，其在肾、结肠、肝、肺等上皮细胞中的表达显著增加[1]。我们前期研究发现，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激HK-2细胞后NGAL mRNA表达显著上调，显著抑制细胞内caspase-3的上调，从而减少受损细胞的凋亡[2]。NGAL是一种急性期蛋白，具有抑制上皮细胞损伤和保护上皮细胞的作用。然而，脓毒症时肾小管细胞中NGAL表达上调的机制尚不清楚。本研究利用LPS刺激来源于正常肾脏的近端小管细胞HK-2细胞，观察NGAL和caspase-3 mRNA表达的变化。此外，使用jnk特异性抑制剂SP600125预处理HK-2细胞，观察上调的NGAL对凋亡关键酶的影响，并识别lps介导的肾上皮细胞损伤中上调NGAL的信号通路及其可能的作用。

2。材料和方法

2.1。材料

永生化人近端肾小管上皮细胞株HK-2从Bioleaf（上海，中国）。包括其它试剂大肠杆菌脂多糖(大肠杆菌O111B4;Sigma, MO，美国)，premium胎牛血清(PAA，奥地利)，DMEM (Gibco，美国)，JNK通路抑制剂SP600125 (Selleck，美国)，PrimeScript™RT regent kit (Takara，日本)，Power SYBR Green PCR Master Mix (Takara，日本)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R&D Systems;明尼阿波利斯,美国)。一抗为兔抗caspase 3单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)β肌动蛋白(σ)。

2.2。引物序列

在PubMed GenBank中搜索引物如表所示1。引物由Invitrogen公司（USA）合成。

2.3。实验方法

2.3.1。细胞培养

HK-2细胞接种于5×10⁷每T25瓶含含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的D-MEM/F12培养基，在37℃、5% CO的加湿气氛中培养₂。常规进行细胞冷冻保存、复苏和传代。

2.3.2。NGAL的测量和Caspase-3 mRNA表达LPS治疗后

HK-2细胞接种于5×10的六孔板中⁵细胞每孔。After 12 hours of culture, they were divided into five groups, a control group (Con) and four LPS treatment groups (LPS 1 h, LPS 3 h, LPS 6 h, and LPS 12 h) in which the cells were treated with 10 μM代表1,3，6和12小时，分别LPS。重复测量三次，每个组。在每个时间点，在培养板中的培养基弃去，将板用PBS洗涤一次。Then, 1 ml of precooled Trizol was added, followed by agitation. The cell suspension in each well was collected in EP tubes and stored at −80°C to detect mRNA expression of NGAL and caspase 3.

2.3.3。SP600125预处理后NGAL和Caspase-3 mRNA表达和蛋白分泌的测量

HK-2细胞（1）培养和处理。HK-2 cells were seeded in a 6-well plate at 2 × 10⁵在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中不加抗生素培养24小时。

细胞分为4组:对照组、LPS组、SP组和SP + LPS组。每组在三口井中重复三次。每组重复测量3次。SP600125 (20μSP组和SP + LPS组的培养基中加入mol/L)，培养2小时。随后，Con和SP组用无血清的DMEM/F12培养基或含10的D-MEM/F12培养基替代μLPS组和SP + LPS组取M LPS，继续培养3小时。

达到时间点后，弃培养板中的培养基，PBS洗涤1次。然后加入1ml的Trizol，搅拌。每孔细胞悬液收集于EP管中，保存于−80℃，检测NGAL和caspase 3的mRNA表达。

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)。从培养皿中收集的HK-2细胞在冰的Trizol中溶解。细胞RNA提取后，使用Nanodrop ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE)分析纯度。通过反转录试剂盒获得cDNAμ升的cDNA用于PCR扩增。PCR was performed under the following conditions: predenaturation at 95°C for 30 s, followed by denaturation at 95°C for 5 s, and annealing at 60°C for 34 s. The amplification was performed for 40 cycles.β肌动蛋白作为内部参照基因。相对基因表达通过ΔΔCT方法与持家基因GAPDH作为内部对照进行分析。

（3）ELISA。如上所述，用LPS和SP600125处理HK-2细胞，收集培养上清。按照说明书使用ELISA试剂盒测定培养上清中NGAL的浓度。

(4)西方墨点法。按照标准方法从细胞裂解液中提取总蛋白。等数量的蛋白质被置于10%的SDS-PAGE中，然后转移到硝化纤维素膜上，该膜上孵育了一抗半胱天冬酶3和半胱天冬酶3的抗体β-肌动蛋白过夜，接着是二级山羊抗兔抗体。最后，扫描western blots，使用进行半定量分析β肌动蛋白作为蛋白上样对照。每个实验至少重复三次。

2.4。统计分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差( )。每组中测试的正态后，用于将LSD方法比较单因子变异数分析。被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。内毒素刺激HK-2细胞影响NGAL表达和凋亡

qRT-PCR检测，HK-2细胞用10μM LPS, NGAL mRNA expression was increased significantly within 6 hours after stimulation and significantly different in LPS 1 h, LPS 3 h, and LPS 6 h groups compared with the Con group (LPS 1 h and 3 h groups vs. Con group, ;lps6h组vs Con组， )。LPS处理后12h NGAL mRNA表达恢复至基线水平，与Con组比较无显著性差异( )。LPS 3 h组HK-2细胞NGAL mRNA表达峰值是基线水平的2.856±0.389倍。HK-2细胞用10μM LPS, caspase mRNA expression was significantly higher within 3 hours after stimulation and significantly different in LPS 1 h and LPS 3 h groups compared with the Con group (LPS 1 h group vs Con group, ;lps3h组vs Con组， )。LPS处理后6h, caspase-3 mRNA表达恢复至基线水平，LPS 6h和LPS 12h组caspase-3 mRNA表达与Con组无显著差异( )。LPS 1 h组HK-2细胞中caspase-3 mRNA表达峰值较基线升高3.029±0.448倍。相关分析显示NGAL与caspase-3 mRNA表达高度相关(r= 0.448, )(图1)。

3.2。HK-2细胞内毒素刺激影响与SP600125 NGAL表达与细胞凋亡预处理后

SP600125预处理后，lps刺激的HK-2细胞NGAL mRNA表达受到抑制，caspase-3 mRNA表达显著增加。LPS组NGAL mRNA表达明显升高( )由Con组中的该2.0倍。另外，胱天蛋白酶-3 mRNA表达显著上调（ )由Con组中的那个2.8倍。SP组NGAL mRNA表达显著抑制（ )到Con组中的41％。然而，与Con组相比caspase-3的mRNA表达表明没有显著变化（ 。与LPS组相比，SB + LPS组NGAL mRNA表达水平明显降低，但略高于SP组(约为Con组的1.5倍)。而SB + LPS组caspase-3 mRNA表达明显升高( )由Con组中的那个3.5倍。它还与SP和LPS组相比，表现出显著上升（与SB基;与LPS组比较)(图2)。我们还测定了HK-2细胞和培养上清中NGAL和caspase 3蛋白的浓度。LPS组和SP + LPS组NGAL和caspase 3水平升高，但SP600125使SP + LPS组NGAL水平较LPS组降低近35% ( ,数字3.)，并使半胱天冬酶3水平升高约50% ( ,数字4)。提示JNK参与了脂多糖诱导的NGAL表达和HK-2细胞的凋亡。

4。讨论

NGAL是Kjeklsen等人发现的[3.,4在基质金属蛋白酶9(也称为92 kDa明胶酶)的研究中。随后，一系列研究表明NGAL是早期诊断急性肾损伤(AKI)的良好生物标志物[5]。然而，NGAL作为肾损伤过程中上皮细胞的急性期蛋白的生物学作用尚不清楚。米什拉等。应用外源性NGAL缺血性AKI大鼠模型，并发现它保护的肾小管上皮细胞，减轻缺血再灌注损伤，抑制和凋亡损伤后[6]。然而，关于NGAL在脓毒症AKI中保护肾脏的作用及其机制的研究很少。在我们之前的体外研究中[2]，细胞凋亡是LPS介导的HK-2细胞损伤的主要病理特征。及时上调NGAL基因的表达在胱天蛋白酶3基因的受损肾小管上皮细胞上调抑制，从而抑制细胞凋亡和减轻细胞损伤。然而，信号通路调控NGAL不清楚。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，可激活肾小管上皮细胞toll样受体4。它还通过NF-诱导各种炎性细胞因子和趋化因子的表达κB途径，导致AKI，并通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族介导炎症损伤[7]。MAPK作为一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号转导系统，是细胞中重要的跨膜信号通路。它有四个家族成员:细胞外信号调节激酶(ERK)、压力激活蛋白激酶JNK (JNK)、p38 MAPK和ERK5 [8]。近期研究发现JNK的激活可上调核心炎症因子如TNF-的合成α，IL-6，和IL-1β，内毒素休克的大鼠模型，并促进炎症因子和进一步活化JNK，由此扩增的内毒素诱导的损伤。所述JNK / MAPK信号传导途径的抑制显著降低了死亡率的败血症[9,10]。SP600125在我们目前的研究中使用的是JNK / MAPK信号传导途径的特异性抑制剂。它通过抑制JNK与竞争的ATP结合位点的激酶。在我们的研究中，我们与抑制的SP100125 JNK通路（20 μM)，然后刺激LPS。接下来我们观察HK-2细胞中NGAL和caspase-3表达的变化，探讨JNK通路在NGAL抑制肾小管上皮细胞损伤中的作用。结果证实SP600125通过阻断JNK通路抑制LPS损伤后HK-2细胞NGAL的上调。这一结果与Konno等人的研究相似，他们的研究显示NGAL mRNA表达被SP600125下调(10)μ在il - 1米)β诱导的犬肾小管细胞[11]。另外，胱天蛋白酶-3的表达，在活化的细胞凋亡的关键酶之一，增加，表明细胞凋亡会在LPS-处理的肾小管上皮细胞来促进。这些结果表明，通过调节JNK的NGAL在肾脏表达的信号传导途径抑制细胞凋亡和衰减内毒素诱发的肾损伤，其可以是急性肾损伤的与脓毒病有关的治疗的新方法。

数据可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文中。

伦理批准

所有实验中的动物的使用和河北医科大学保护的地方委员会的批准。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

MH进行了实验和数据分析，参与了研究设计，并起草了手稿。ZLZ和FW概念化设计了这项研究，并监督了这项工作。MYG和YXP为研究提供了智力输入，并帮助修改稿件。所有作者阅读并批准了最终的手稿。所有作者对手稿的贡献相等，并认可最终版本。

致谢

作者从理文便即，理文集团（中国）（感谢米切尔阿里科http://www.liwenbianji.cn/ac)，用于编辑该手稿的英文草稿。这项工作获得了河北省重点研发计划(资助号172777161)和河北省医学科学研究重点项目(资助号20170548)的资助。

参考

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