乳腺癌亚型中羊肾上腺受体，miR-185，miR-205和miR-21的淋巴结状态和表达水平之间的关系

摘要

乳腺癌是女性中最常见的癌症。乳腺癌治疗的困难与疾病早期发生转移有关，导致其进一步发展。近年来的研究表明，雄激素受体(AR)和microrna表达的变化与乳腺癌变，特别是转移瘤的形成有关。因此，为了识别新的转移性标志物，我们评估了AR的表达水平;miR-185和miR-205，均被证实靶向AR;在乳腺癌样本中，miR-21的转录受AR调控( )．在这里，我们表明乳腺癌的分子亚型在Ar和Ar相关的微大罗斯的表达谱不同。此外，AR和这些微小RNA的表达可以取决于PR，ER和HER2受体的表达。我们的研究结果表明，使用Ar和microRNA作为标记的可能性取决于肿瘤亚型：AR表达的降低可以是乳腺癌患者患者淋巴结转移的标志物，以及MIR的扰动-205，miR-185和miR-21表达可以是患有腔B Her2阳性亚型的患者的标志物。与非组织案例相比，这种类型的乳腺癌中的转移患者的转移含量较高，肿瘤组织中的miR-185和miR-21的较低水平。miR-185水平的降低也与腔B Her2阴性乳腺癌中的淋巴结转移相关。因此，Ar，miR-185，miR-205和miR-21的表达水平可以用作标记，以预测癌症扩散到乳腺癌的腔B-和Her2阳性亚型中的淋巴结。

1.介绍

乳腺癌(BC)是女性中最常见的癌症。据国际癌症研究机构(IARC)估计，2018年全球发现约200万例这类癌症病例[1］．

XX世纪末标志着BC治疗的重大进展。当时，以2000年提出的分子分类为基础，开始确定治疗方法。这种分类根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、Her2/neu受体和Ki67的表达水平将BC分为不同的亚型[2］．但尽管在治疗和诊断方面取得了进展，BC治疗仍然存在很大困难，这在很大程度上是因为近30%的早期乳腺癌患者会发展为转移性疾病[3.］．淋巴结通常是转移的第一个部位。因此，为了成功地对抗这种疾病，早期发现转移是绝对必要的。

大量研究表明，microrna在癌症的发展和进展中发挥着重要作用。microrna是一种短的非编码rna(长度为19-25个核苷酸)，通过与mrna靶点相互作用调节基因表达。microrna可执行肿瘤抑制和致癌功能，并影响与肿瘤发展相关的各种过程[4.-6.］．最近，许多出版物一直专注于雄激素受体（AR）在BC开发和进展中的作用[7.-9.］．从这些研究，雄激素受体表达成为一个新的预后因素。

在这项研究中，我们研究了AR，MiR-185，MiR-205的表达水平变化之间的关系，其中AR确认为靶标，miR-21（其转录受Ar）和肿瘤亚型（和它的主要特征如T阶段，n阶段和ER，PR和HER2的表达水平）。

2.材料和方法

2.1。组织样本和乳腺肿瘤亚型的定义

在2017年新西伯利亚市预算医疗保健机构“市政临床医院”（ )．组织样本放置在RNAlater™稳定溶液(Invitrogen™，美国)中，并保持在-20℃，直到进行实验。所有实验程序均由分子生物学和生物物理学研究所的生物伦理委员会批准。临床病理资料通过查阅医疗记录和免疫组化检测结果报告获得。确定以下变量:T分期、N分期、ER、PR、HER2、Ki-67表达免疫组化评分(表1)1)．根据St. Gallen专家共识对乳腺癌亚型进行了如下分类[10]：Luminal A（ER +和/或PR +，HER2-和），Luminal B Her2阴性（ER +和/或PR +，HER2-和）luminal B HER2阳性(ER+和/或PR+， HER2+)， HER2阳性(ER -， PR -和HER2+)，三阴性(ER -， PR -和HER2-)。


特征	鲁米那( ）	Luminal B Her2-Digal（）	Luminal B Her2阳性（）	HER2阳性（）	三负（）

年龄(平均及范围，年)	61 (41 - 78)	52（27-83）	55（39-70）	52 (42 - 61)	52 (40 - 74)
T舞台
T1	9.	9.	7.	5.	7.
T2	15	10	12	7.	4.
T3	-	-	-	-	-
T4	-	1	1	1	1
N阶段
N0	16	11	8.	7.	9.
N1	6.	6.	9.	2	1
N2	-	3.	1	3.	2
N3	2	-	2	1	-
ER得分
0-2	-	3.	1	-	-
3 - 5	2	5.	3.	-	-
6 - 8	22	12	16	-	-
公关的分数
0-2	1	2	4.	-	-
3 - 5	9.	9.	6.	-	-
6 - 8	14	9.	10	-	-
HER2的分数
1	-	-	13	5.	-
2 - 3	-	-	7.	8.	-

除非另有说明，否则将呈现为患者数量。ER和PR使用ALLRED进行分级[11]评分方法。

2.2。RNA分离，cDNA合成和实时PCR

根据制造商的协议，使用TRIzol™Reagent (Invitrogen™)分离RNA。糖原(Thermo Scientific™，USA)被用作RNA共受体。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用Agilent-8453分光光度计(Agilent Technologies, USA)在260和280 nm波长下评估RNA浓度和纯度。逆转录使用RT-M-MuLV-RH试剂盒(BiolabMix, Russia)，按照生产商的方案进行逆转录。RNA浓度为0.8μG用于逆转录反应。将cDNA用于实时PCR，通过添加BioMaster HS-qPCR SYBR Blue (2x) (BiolabMix)反应混合物，然后应用CFX96™检测系统(Bio-Rad Laboratories, USA)来检测AR mRNA的水平。讨论和POLR2A用作参考基因。本研究中使用以下特异性引物：AR.5. -CCTGGCTTCCGCAACTTACAC-3 那5. -GGACTTGTGCATGCGGTACTCA-3 ;讨论5. -GCTGGAGAAAAGAGGGTG-3 那5. -ACAGGTTGGTGGCTTTGATG-3 ;和POLR2A5. -gcatggcagaggagtttcggct-3 那5. -Atttccccgggatgcgcaatgg-3 。

每个引物的最佳浓度为300nm。

通过使用0.3来进行每个PCR反应 μl CDNA，最终卷20 μL，在下列条件下[12]：在95℃下初始变性5分钟，然后在95℃下进行40个变性，在95℃下，在62℃，伸长率和荧光数据处理时为72℃的荧光数据处理。使用熔化型材来评估PCR特异性。在每个实验中，一块板含有分析的cDNA的样品，其具有AR基因的引物和参考基因（每个样品重复）。基于考虑分析和参考基因的PCR功效（E），基于考虑PCR功效（e）来评估相对基因表达水平。

２.３.MicroRNA分离、MicroRNA逆转录和实时PCR检测MicroRNA水平

为了分离miRNA，将50 mg组织样本与500 mg组织样本结合μl胍基溶解缓冲液(4 M异硫氰酸胍、25 mM柠檬酸钠、0.3%肌糖基、0.1% 2-巯基乙醇和25 mM ch3cooa) [12］．混合后在65℃孵育10 min。样品于10000 g离心2 min。取上清加入糖原溶液，与等体积异丙醇混合，室温孵育5min, 10000 g离心10min。滗上清液，用500洗涤μL为70％ETOH和300 μl丙酮，干燥，并溶解于200 μL mq-h2o。

实时逆转录- pcr检测miR-205、miR-185和miR-21的相对表达水平。利用茎环引物进行逆转录反应[13根据制造商的协议，据制造商的rt-m-mulv-rh套件（Biolabmix，俄罗斯）。根据制造商的协议，使用Taqman探针和PCR套件与BioMaster UDG HS-QPCR（Biolabmix，俄罗斯）一起使用Taqman探针和PCR试剂盒进行实时PCR。为了检测PCR产品，应用CFX96™检测系统（美国生物-RAD实验室）。使用小核RNA U44和U48标准化数据。

用于MicroRNA的逆转录反应的引物：miR-205 5 -GTC gta TCC agt gca GGG TCC gag gta TTC gca CTG gat acg acc aga CTC c-3 那mir - 185 5 -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACT CAG GAA C-3 那mir-21 5 -GTC gta TCC agt gca GGG TCC gag gta TTC gca CTG gat acg act caa cat c-3 那U44 5 -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA GTC AGT T-3 那和U48 5 -GTC gta TCC agt gca GGG TCC gag gta TTC gca CTG gat acg aga CGG tСa g-3 。

引物序列基于从MiRBase数据库中取出的成熟微大RNA的序列。到3. -引物末端加入6-8个核苷酸的microrna特异性序列进行逆转录反应。正向引物与3位点的14-16个核苷酸互补 -反转录产物的末端。

在每个实验中，分析的cDNA与靶和参考SNRNA特异的引物一起置于相同的96孔板（每个样品一式三份）中。考虑分析和参考基因的PCR功效（E），基于阈值循环（CT）值来评估相对表达水平。使用以下特异性引物：miR-205（前进）5 -GCCGCTCCTTCATTCCACC-3 那（探测）5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGACCAGACTCC - (BHQ1) 3 ;mir - 185(向前)5 -GCCGCTGGAGAAAAGGCA-3 那（探测）5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGACTCAGGAAC - (BHQ1) 3 ;miR-21(向前)5 -GCCGCTAGCTTATCAGACT-3 那（探测）5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGACTCAACATC - (BHQ1) 3 ;U44（前进）5 -GCCGCTCTTAATTAGCTCT-3 那（探测）5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGACAGTCAGTT - (BHQ1) 3 ;和U48（前进）5 -ccctgagtgtgtcgctgatg-3 那（探测）5 -(R6G) -TTCGCACTGGATACGAGACGGTСAG - (BHQ1) 3 。针对合成的cdna中茎环区域的类似反向引物如下 -AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3 。

3.统计分析

数据作为中值值呈现。使用非参数曼诺 - 惠特尼进行比较群体测试。一个被认为具有统计学意义。

结果

4.1。miR-205，miR-185，miR-21和乳腺癌亚型的表达水平的关系

首先，根据乳腺癌亚型检查AR和MicroRNAS的表达。我们选择MIR-205，MIR-21和MIR-185进行分析，因为它先前报道了AR是MIR-205和MIR-185的目标[14那15而miR-21的转录受AR调控[16］．RT-PCR检测89对肿瘤组织和健康组织中AR mRNA和上述microrna的相对水平(见表1)2)．我们观察到在管腔B her2阳性和管腔B her2阴性亚型中miR-205和miR-185水平显著下降。在三阴性BC中，miR-205的表达也降低了5倍。MiR-21在所有肿瘤亚型中的表达均增加。三阴性组AR mRNA水平降低8倍，her2阳性组降低3倍。


亚型	患者数量	相对水平miRNA或mRNA和价值
亚型	患者数量	MIR-205.	价值	MIR-185.	价值	MiR-21.	价值	AR.	价值

鲁米那一个	24	0.25 (0.09 - -2.14)	0.070	0.55 (0.12 - -2.03)	0.136	5.14 (0.79 - -35.15)	<0.001	0.85（0.35-2.35）	0.295
Luminal B（HER2-DIALY）	20.	0.21（0.06-2.91）	0.041	0.25（0.06-1.54）	0.005	3.53 (0.87 - -37.83)	<0.001	0.91（0.44-2.35）	0.438
Luminal B（HER2阳性）	20.	0.25（0.03-1.56）	0.003	0.28（0.08-3.16）	0.035	13.98（0.39-64.68）	0．002	0.88 (0.29 - -2.40)	0.381
her2阳性	13	0.52 (0.11 - -1.39)	0.115	0.48 (0.11 - -1.60)	0.115	6.68 (0.72 - -20.50)	0.018	0.33 (0.04 - -0.74)	0.001
三阴	12	0.19（0.03-0.94）	0.001	0.41 (0.09 - -1.42)	0.104	5.02（0.81-21.54）	0.027	0.12 (0.01 - -0.31)	<0.001

MicroRNA或mRNA水平的中位和范围的乳腺肿瘤与配对正常（邻接）组织。

4．2.miR-205、miR-185、miR-21和AR的表达与肿瘤的临床病理特征的关系

接下来，我们评估了microrna或AR的表达与肿瘤临床病理特征的关系(表)3.)．我们发现miR-205水平与腔内B her2阳性BC型的淋巴结转移有关。与无淋巴结转移的患者相比，有淋巴结转移的患者BC组织中该microRNA水平较高。管腔B her2阴性和管腔B her2阳性BC型淋巴结转移患者组织中miR-185水平降低。在luminal B her2阳性乳腺癌中，转移患者样本中miR-21的水平也较低。在her2阳性的BC亚型(er阴性、pr阴性和er阳性、pr阳性)中，AR mRNA水平的降低与淋巴结转移有关。此外，在er阴性、pr阴性亚型中Ki-67较高的患者BC组织中AR mRNA水平有降低的趋势。


特征			相对水平miRNA或mRNA和价值
			MIR-205.	价值	MIR-185.	价值	MiR-21.	价值	AR.	价值

鲁米那一个

T舞台	T1.	9.	0.96	0.132	0.41	0.895	10.02	0.433	0.92	0.332
	T2.	15	0.25		0.79		4.58		0.84

N阶段	N0.	16	0.45	0.867	0.55	0.632	7.10	0.285	0.82	0.824
	n1-n3.	8.	0.22		0.68		1.98		1．16

公关的分数	0 - 5	10	0.12	0.006	0.41	0.365	2.92	0.423	0.69	0.151
	6-8	14	0.91		0.99		7.51		0.86

ER得分	0 - 5	2	０．３７	0.412	1.30	0.208	14.61	0.952	0.84	0.960
	6-8	22	0.34		0.32		5.14		0.86

ki - 67指数(%)	＜10	10	0.22	0.594	0.18	0.082	6.68	0.689	0.81	0.765
	≥10	14	0.34		0.99		3.60		0.85

Luminal B（HER2-DIALY）

T舞台	T1.	9.	0.46	0.082	0.22	0.138	4.17	0.832	1.17	0.399
	T2-T4	11	0.17		0.68		7.43		0.78

N阶段	N0.	11	0.13	0.100	0.91	0.045	7.14	0.307	0.94	0.862
	n1-n2.	9.	0．35		0.13		2.89		0.97

公关的分数	0 - 5	11	0.17	0.022	0.90	0.033	7.28	0.637	0.74	0.010
	6-8	9.	1.89		0.13		4.17		1.57

ER得分	0 - 5	8.	0.13	0.587	0.47	0.459	9.01	0.551	0.61	0.008
	6-8	12	0．23		0．14		5.01		1.47

ki - 67指数(%)	< 20	10	0．14	0.958	0.19	0.452	7.14	0.916	1.41	0.810
	≥20	10	0.17		0.88		4.17		0.89

Luminal B（HER2阳性）

T舞台	T1.	7.	0.32	0.725	1.58	0.040	20.33	0.248	0.88	0.895
	T2-T4	13	0.18		０．２０		4.05		0.89

N阶段	N0.	8.	0.08	0.008	1.03	0.036	36.07	0.045	1.17	0.036
	n1-n3.	12	0．35		0.22		5.18		0.59

公关的分数	0 - 5	10	0.12	0.043	1.92	0.031	23.82	0.431.	0.80	0.930
	6-8	10	0.45		0．23		12.05		0.88

ER得分	0 - 5	4.	0．16	0.585	1.50	0.845	11.79	0.585	0.76	0.764
	6-8	16	0.22		0.34		13.38		0.78

HER2的分数	1	13	0．35	0.116	0．31	0.018	3.05	0.006	0.88	0.693
	2-3	7.	0．15		2．50		46.55		0.88

ki - 67指数(%)	< 20	9.	0.18	0.927	0．24	0.262	9.29	0.525	0.80	0.653
	≥20	11	0.27		0.61		17.81		0.86

her2阳性

T舞台	T1.	5.	0．15	0.156	0.73	0.777	3.85	0.366	０．３３	0.915
	T2-T4	8.	1．01		0.21		10.17		0.26

N阶段	N0.	7.	1．07	0.897	0.43	0.713	9.28	0.270	0.39	0.022
	n1-n3.	6.	0.39		０．２０		5.22		0．10

HER2的分数	1	5.	0.18	0.167	0.27	0.167	5.53	0.915	0.12	0.362
	2-3	8.	1.17		1．09		9.28		0.34

ki - 67指数(%)	< 40	6.	1.17	0.235	0.57	0.523	6.68	0.835	0.43	0.095
	≥40	7.	0.52		0.29		7.20		0.08

三阴

T舞台	T1.	7.	0．05	0.136	0.41	0.749	12.79	0.391	0.13	0.056
	T2-T4	5.	0.27		0.49		4.59		0.03

N阶段	N0.	9.	0.13	0.171	0．24	0.362	5.02	0.868	0.13	0.820.
	n1-n3.	3.	0.49		0.95		4.30		0.13

ki - 67指数(%)	<70	4.	0．16	0.915	0.81	0.110	9.91	0.156	0．15	0.110
	≥70	8.	0.17		０．２０		2.62		0．05

乳腺肿瘤中miRNA或mRNA水平相对变化的中值与配对正常（邻接）组织。

我们还评估了MicroRNA和AR mRNA水平与ER，PR和HER2的表达之间的关系。我们发现，对于所有Luminal BC亚型，MIR-205级别明显高于PR表达（根据IHC测定的6-8分）比表达值的0-5分。相反，MiR-185的表达水平较低，Luminal B Her2阴性和腔B Her2阳性亚型中的PR表达较高。此外，我们检测到腔B HER2阴性亚型中的ER和PR的表达和AR mRNA水平之间的关联：AR mRNA水平在具有更高的ER和PR表达的样品中增加。miR-185和miR-21的表达水平与HER2的表达水平相关。因此，在Luminal B亚型中，当HER2表达的评估具有2-3分时，这些微小RNA的水平增加。检测对ER阴性的PR阴性HER2阳性BC亚型的类似趋势，但表达差异并不可靠地显着。

5.讨论

在人类恶性肿瘤的诊断和治疗中取得了重大进展，但癌症仍然是全世界死亡原因之一。乳腺癌占女性癌症诊断的约23％[17］．大约三分之一的女性在BC的早期阶段就有转移，这导致了病情的进一步复发和恶化，这一事实使情况变得复杂[18］．BC转移的早期检测对于监测BC进展和预测疾病结果是重要的。因此，鉴定可能表明转移存在的标记仍然是对抗这种癌症的优先级。MicroRNA在癌症中的一类新的生物标志物中表现出巨大的潜力。然而，无论肿瘤亚型如何，都会对乳腺癌中的MicroRNA作用的大多数研究。

雄激素受体在前列腺癌治疗中是一个重要的治疗靶点，但最近的研究表明，它在BC中也有治疗和预后价值[19］．通常，AR的表达与ER阳性肿瘤有利的预后相关，而AR在ER阴性中的作用的研究结果是有争议的。各种作者报道了乳腺癌三重阴性亚型的AR阳性之间的关系，以及淋巴结转移的高或低频频率[9;20]，高或低增殖活性[7;9]，肿瘤大小，生存率低[20.］．因此，AR可以在BC中显然发挥肿瘤抑制和致癌作用。

众所周知，在几乎所有的ER阳性肿瘤中都表达了AR;然而，在ER阴性肿瘤中，在分子亚型HER2 +的肿瘤中主要观察到AR表达。21］．我们的研究结果与之前获得的数据一致。我们发现AR在管腔亚型中表达高水平，但受体表达在三阴性亚型中减少8倍，在her2阳性亚型中减少3倍。同时，腔B肿瘤中ar调节microrna (miR-205和miR-185)水平降低。三阴性亚型的miR-205水平也降低，与之前获得的数据一致[22］．

然而，实际的任务是寻找与肿瘤临床病理特征相关的标志物。在我们的研究中，我们发现AR表达降低表明her2阳性肿瘤亚型的淋巴结转移。与其他亚型BC无淋巴结转移患者的肿瘤组织相比，转移灶患者肿瘤组织中AR的表达无变化。此外，管腔B HER-2阳性亚型中，N1-N3期患者组织中miR-205水平明显高于N0期患者组织。提示该microRNA可能在抑制该肿瘤亚型AR表达的机制中发挥作用。

MicroRNA-185在乳腺癌中是一种被广泛研究的肿瘤抑制因子;该水平的下降已被证明与临床阶段和淋巴结转移有关[23］．在本研究中，在淋巴结转移患者中也观察到该microRNA水平的下降，但仅在管腔B her2阴性和管腔B her2阳性的BC亚型中。这种microRNA水平的降低也与腔内B her2阳性亚型的T2-T4分期有关。

microRNA -21是一种致癌microRNA，其启动子中有AR结合位点[16］．miR-21在人前列腺癌细胞中被AR激活，在乳腺癌细胞中在雄激素的影响下表达降低[24］．在我们的研究中，miR-21的水平在所有亚型的BC中均升高，但在腔内B her2阳性亚型的BC中，与无淋巴结转移的BC患者相比，有淋巴结转移的患者组织中显著降低。在其他亚型中也观察到类似的趋势。

同时,我们发现AR表达取决于公关和ER表达水平在腔内B her2阴性亚型:公元前组织的AR mRNA水平增加患者公元前这些受体的高表达与组织的低表达患者的公关和ER。miR-205的水平也依赖于PR的表达水平。在所有腔内亚型中，PR表达IHC评分为6-8的患者肿瘤组织中miR-205的表达均高于PR表达IHC评分为0-5的患者肿瘤组织中miR-205的表达。而在luminal B亚型中，PR高表达的患者的BC组织中miR-185表达水平较低。根据TargetScan数据库，PR是miR-185的潜在靶点。因此，miR-185水平的降低可能是导致luminal亚型PR表达紊乱的机制之一。

miR-185和miR-21的表达水平与Her2受体表达有关，在患有腔B亚型中具有较高HER2表达的患者的肿瘤组织中显着增加。患者患有类似的趋势，逆阴性HER2阳性BC患者。

6.结论

因此，我们的研究表明，乳腺癌的分子亚型在AR的表达谱和其相关的miR-205，miR-185和miR-21中不同。此外，AR和这些微小RORNA的表达可能取决于对乳腺癌控制 - PR，ER和HER2重要的其他受体的表达。使用Ar和miRNA作为标记以检测淋巴结转移的存在的可能性也取决于肿瘤亚型-A-AR表达水平的降低可以用作HER2阳性亚型中的标记，以及更高水平的miR-205表达和miR-185和miR-21表达水平的减少（与没有转移酶的情况相比）可以是Luminal B Her2阳性乳腺癌转移的标志物。miRNA-185水平的降低也与腔B Her2阴性乳腺癌中的淋巴结转移相关。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

伦理批准

所有程序符合机构研究委员会的道德标准，并与1964年赫尔辛基宣言及其后期修正案或可比的道德标准。我们收到了所有患者的书面同意。

的利益冲突

作者宣布没有对财务或任何其他领域的利益冲突。

致谢

我们感谢联邦国家预算科学机构分子生物学和生物物理学研究所(蛋白质组学分析)中心“联邦基础和转化医学研究中心”(IMBB FRC FTM)允许使用设备。这项研究得到了俄罗斯科学基金会的支持(批准号19-15-00319)。

参考文献

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国际乳腺癌杂志