同时测定甲基苯丙胺和3,4-亚甲基二氧基的有效方法N- 在血基液相色谱 - 串联质谱中的离氨基

抽象的

验证了液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定血液样本中甲基安非他明(MA)和3,4-亚甲基二氧基- n -甲基安非他明(MDMA)的方法。在最佳实验条件下，MA的浓度可确定在1µg / l到5000 µG / L具有0.31的方法检测限（MDL） µg / L。范围从0.5到500µg/L, MDL降至0.25µg / L。该方法的实际适用性是在MA的85.3％至94％的恢复中进行，MADMA的86.9％至95.5％。在不同浓度的药物中，MA和MDMA的相对标准偏差（RSD）低于5.7％。该方法用于分析1995年从胡志明市法医医学中心收集的血液样本。结果表明1.75％阳性，MA和0.25％阳性MDMA阳性。这两种药物占总药物阳性样品的10％。通过使用氘标记的甲基苯丙胺-D5和3,4-甲基二氧基-N-甲基甲烷-D5作为内部标准的确定和使用MS / MS在多次反应监测模式信号读数中，该方法表现出鲁棒性特异性，并且可以是具有高选择性和敏感性的血液中MA和MDMA的同时测定。

1.介绍

近几十年来，许多国家的非法使用甲基苯丙胺，3,4-甲基二氧基-N-甲基苯丙胺和其他精神疗法药物的含量显着增加[1］．甲基苯丙胺和3,4-甲基二氧基-N-甲基甲基甲基甲基甲酸甜胺型兴奋剂。它们是具有兴奋剂或致幻性质的滥用药物[2，3.］．在安非他明类兴奋剂中，MA是中枢神经系统的强效兴奋剂，是滥用最频繁的药物。MA被命名为冰毒、蓝色、冰和晶体等许多术语，它以一种白色、无味、苦味的晶体粉末的形式出现，很容易溶解在水或酒精中。接触MA与大脑中已知影响注意力和行为的区域的神经化学和结构改变有关[4，5］．产前接触MA已显示出对母亲和后代的有害MA诱导效应。除了眼部结构缺陷，运动发育迟缓和学习障碍[6，7，另一种安非他明类兴奋剂是MDMA，它在年轻人中被广泛用作娱乐性药物。MDMA已被证明可以减少成人大脑中5-HT的表型表达[8，9］．一些证据表明mdma诱导的成人血清素神经毒性的表型损失[10.，11.］．

对吸毒者进行诊断和治疗，血液中MA和MDMA水平的评估是必不可少的一步。气相色谱-串联质谱(GC/MS)已用于这些药物的分析多年[12.，13.]但它有时会持挑战性，施加到无衍生物的无衍生化而不是极性的非挥发性药物。最近，已选择高效液相色谱 - 串联质谱法用于测定MA，MDMA和其他兴奋剂，但这些方法仅用于药品的分析，尿液样本[14.，15.］．使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的高效液相色谱法也被验证用于血液样本中MA和MDMA的分析[16.］．虽然需要一个非常小的样本(20µL)，但仍存在样品制备多步、定量范围窄(0.003 ~ 0.050 mg/L)等缺点。MA和MDMA血液中毒性浓度MA可达40 mg/L, MDMA可达0.5 mg/L，该方法不能用于评价和分类这些药物在血液样本中的作用水平(治疗级、毒性级和昏迷致死性级)[17.- - - - - -19.］．针对这一点，本研究旨在验证一种高效液相色谱-质谱/质谱联用同时测定血液样品中MA和MDMA的灵敏方法，以便进一步应用于实际样品中MA和MDMA的分析。本方法以氘标记的MA-d5和MDMA-d5为内标，采用MS/MS多反应监测模式信号读取，具有较高的特异性和敏感性。此外，通过使用真实血液样本进行验证，该方法可以获得高可信度的优点，可用于诊断、治疗或药物毒理学。

2.实验

２.１.材料和试剂

在这项工作中使用的所有试剂都是分析级。在甲醇中的甲基苯丙胺1mg / ml，3,4-甲基二氧基-N-甲基甲基甲基甲醇，甲醇-D51mg / ml在甲醇中，3,4-甲基二氧基-N-甲基甲基-D51mg / ml在甲醇中购自Sigma-Aldrich（新加坡）。乙腈（ACN），甲醇，丙酮，二氯甲烷，2-丙醇，NH₄哦,25%,KH₂宝₄，na₂HPO₄，和Lichrolut®RP-18（40-63 µm）500 mg 3 ml标准pp-管购自Merck（默克，德国达摩尔施塔特）。使用纯水（具有由Millipore Milli Q系统（Billerica，MA，USA）生产的超纯水（具有电阻率>18.3MΩcm）制备和稀释所有溶液。标准和内标工作溶液（100mg / L）由库存标准溶液（1000mg / L）制备，并将这些溶液储存在4℃以便在3个月内使用。

２.２.HPLC-MS / MS分析

根据先前的报告制备血样[20.，21.，简单描述如下:2 mL血样中加入250µL MA-d5 2 mg/L和250µL MDMA-d5 2mg /L入15ml离心管中，此混合物漩涡15分钟，然后静置10分钟。将混合物8000 rpm离心5分钟后，用C18萃取柱清洗上清液，分四步进行:(1)用1ml甲醇、1ml蒸馏水、1ml磷酸盐缓冲液(pH = 6)活化色谱柱;(2)在1分钟内上样1ml;(3)用5ml蒸馏水/丙酮(20:80,v/v)冲洗色谱柱，等待冲洗液在5min内完全流出色谱柱;(4)分析物用1ml甲醇洗脱。将得到的溶液蒸发并在500中再稀释μ.L Meoh然后过滤通过0.45 μ.m滤纸。5µL最终溶液在操作条件下用HPLC-MS/MS分析，操作条件见表1．

3。结果与讨论

3.1。该方法的特异性

为了确认血液中MA和MDMA检测的准确性，根据ASB Standard 036-2017和ANSI/ASB Standard 072-2019的指南对特异性、线性、方法检测限(MDL)、准确性和精密度进行了评估[22.，23.］．

通过分析标准来验证MA和MDMA的表征。在多重反应监测模式（MRM）中观察色谱光谱，其中质量片段如图所示1和2．保留时间、前驱体、量化和确认片段如表所示2．

通过对空白样品和加标样品的分析，验证了MA和MDMA检测的特异性。观察每种分析物的产物片段的MRM色谱图，以确认方法的特异性。空白样品色谱图显示，定量离子保留时间为0 ~ 3min(150 > 91)，无任何信号。相反，当峰值为0.2时µg/L MA至空白样品时，单峰在~ 0.441 min出现(图1)3(一个))．还可以获得类似的结果用于确认离子（150> 119）（图3 (b))．这证实了空白矩阵对MA检测没有任何干扰信号。记录MDMA鉴定片段(194 > 105)和确认片段(194 > 163)的色谱图。空白基质中无明显峰值，但随添加量的增加而发生明显变化µg/L MDMA样品(图4)．所有这些结果证实了检测血液样本中MA和MDMA的方法的高特异性。

３．２．方法的线性性

使用矩阵匹配的校准以使矩阵效应最小化对分析信号。空白矩阵同时用适量的MA和MDMA，250飙升 µL MA-d5 2 mg/L和250µL MDMA-d5提取前为2mg /L，根据本节分析2.2．标定曲线是分析物各标准品的峰面积比(sd)与内标(isd)与浓度速率之间的关系。如表所示3.，血液中MA的测定范围为1µg / l到5000 µg / l具有系数相关性（R²0.998的0.998。用于MDMA可以分析的浓度为0.5至500 µg / LR²~ 0.999。这是一个广泛的范围，可以测定血液中MA和MDMA的低浓度。在3天内观察了线性的稳定性。MA和MDMA的相关系数稳定在0.998 ~ 0.999。这些结果表明，两种校正曲线均可用于血液样品中MA和MDMA的测定。

３．3.方法检出限和定量限

基于对掺入样品的分析，评估了测定血液中MA和MDMA的方法检测和定量限制。进行了三个尖刺样品的11次重复实验。空白样品用于MA和MDMA为阴性。该方法的MDL计算为标准偏差的三次（SD），MQL为SD的十倍。MDL的MA测定低于0.31 µg/L < 0.25µg / l对于mdma（表4)．在MDL级别，定量离子信号相对于确认离子信号的响应比为MA和MA的0.43，对于MDMA为0.51。这些值是统一的，校准范围级别确认所获得的MDL被校正。这比先前报道的10倍16.］．结果表明，该方法对血液样品中MA和MDMA的测定具有很高的灵敏度。

3．4．方法的准确性和精密度

通过比较从MA，MDMA掺入血液中的信号在萃取之前通过比较从MA，MDMA的信号掺入MeOH，以相同的最终体积掺入MeOH之前来计算提取恢复。提取恢复为MA和MDMA的89-97％。由于缺乏经认证的参考资料，通过血管无价性再现性（％恢复）评估了这一真实性。样品的恢复试验结果以三个水平尖刺：10,100和300 µg/L MA和MDMA在三个不同的天由两名分析师。MA和MDMA的回收率分别为85.3 - 94%和86.9 - 95.5%5)．在差异天和分析师的差异中恢复稳定（RSD）低于5.2％。

还在三种血液样品的六次重复分析中评估该方法的可重复性。在MA水平为24.8,102.6和281.9的MA水平下相对标准偏差为5.2％，4.5％和4.3％ µ分别g / L。MDMA浓度下的RSD分别为17、137.3和314.6µg/L分别为5.7%、4.3%和4.8%。根据ABS标准036-2017，这远远低于可接受的最大RSD值(<20%)。因此，该方法对血液中MA和MDMA的测定具有较高的准确度和精密度。

3.5。血液样品中MA和MDMA测定方法的应用

该方法用于1995年血样的分析。这些样本是从胡志明市法医中心收集的，并分析了MA、MDMA和其他药物，如吗啡、可待因、对乙酰氨基酚和氯胺酮。药物阳性样本占总样本的比例为10.02%，其中MA阳性样本占1.75%，MDMA阳性样本占0.25%。在各种药物范围内，女性MA、MDMA和其他药物的阳性样本分别为25.7%、40%和5.6%。MA、MDMA阳性血液样本的相关丰度也在总药物阳性样本内进行比较。MA、MDMA和其他药物的比例分别为17.5%、2.5%和80%(图)5)．

结果还分类为对人类健康影响的药物浓度的范围。对于MA，治疗性，毒性或腺样的浓度范围为0.01-0.2mg / L，0.2-10mg / L和> 10mg / L.MDMA的范围为0.1-0.35mg / L，0.35-0.5mg / L，> 0.4mg / L [17.- - - - - -19.］．在总MA阳性中，治疗浓度为55％，毒性水平为45％。没有观察到的样本具有伴奏致命效果的MA水平。对于MDMA获得类似的结果，其治疗壳中百分比为60％，在阳性样品中的毒性病例中40％。

4。结论

综上所述，验证了基于氘标记内标和液相色谱-串联质谱同时测定血液样品中MA和MDMA的灵敏方法。该方法对血液中MA和MDMA的测定具有超敏性和选择性。在此基础上，得到的校正曲线范围广，相关系数高(>0.998)，方法检出限极低(~0.3)µg / l）。还获得了所需的精度和精度，相对标准偏差低于5.7％。恢复范围从85.3到95.5％。通过评估真实样品中的MA和MDMA来证明这项工作的实际实用性。1995年人血液样品，MA和MDMA阳性壳体分别为1.75％和0.25％。与血液样本中的其他药物相比，MA和MDMA占用了10％;这表明这些药物普遍使用。大多数MA和MDMA阳性样品在治疗或有毒水平上，并且在婚姻致命水平中没有阳性样品。在一起，这项工作提供了一种超敏和准确的方法，用于测定血液样品中的MA和MDMA。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者报告了这项工作没有利益冲突。

致谢

作者要感谢Ho Chi Minh City的工业大学进行财务支持。

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