超高效液相色谱串联质谱法分析肺癌患者干血斑中的丙烯酰胺

摘要

丙烯酰胺（AA）是在食品，香烟烟雾和在暴露于丙烯酰胺的环境中发现的致癌物质。本研究旨在分析在干血点（DBS）的肺癌患者与吸烟纪录的样品AA级别，不吸烟的记录，同时也否定的空白。AA水平的分析通过液相色谱串联质谱法（LC-MS / MS）和DBS提取使用蛋白质沉淀技术来确定。质量检测，使用正电子喷雾电离（ESI）和多反应监测（MRM）型用做米/z丙烯酰胺为71.99 >，为55.23米/z内标为普萘洛尔260.16 > 116.04。有吸烟记录的肺癌患者AA水平为4.670μ11.986 g / mLμ克/毫升。无吸烟记录的肺癌患者AA水平在2.041范围内μ12.702 g / mLμ克/毫升。负性空白AA水平数据在2.72范围内μ3.51 g / mLμ克/毫升。独立样本的结果t以及( ）有吸烟记录者与无吸烟记录者AA水平无显著性差异。然后对肺癌组与阴性空白组进行Mann-Whitney检验，两组间有显著性差异( ）。

1.介绍

肺癌是导致死亡的最大原因之一(180万人死亡，占总数的18.4%)，原因是这种癌症预后不良[1］．大约85%的肺癌病例是由吸烟引起的。香烟烟雾含有60多种有毒化合物，可导致癌变[2］．香烟烟雾中致癌物的一种组分是丙烯酰胺[3.］．据报道，香烟烟雾中含有超过1μg的AA/香烟[4，5]，据估计，吸烟可导致丙烯酰胺摄入量3μ克/公斤/天(5，6］．

国际癌症研究机构(IARC)将丙烯酰胺分为2A组(可能对人类致癌)。在高碳水化合物含量的食物中也发现丙烯酰胺的形成，如炸薯条、薯片、炸红薯、爆米花、谷物、面包和饼干，这些食物都要经过超过120°C的高温加热阶段[7］．这样的加热可导致氨基酸天冬酰胺和其还原糖[之间的美拉德反应8，9］．世界卫生组织指出，在一般人群中，丙烯酰胺通过食物的平均摄入量在0.3-0.8之间μ克/千克体重/天[7］．

CYP2E1将丙烯酰胺代谢成甘酰胺，最终起到致癌物的作用。甘酰胺会与DNA结合形成DNA加合物，这被认为是丙烯酰胺暴露致突变性和致癌性的主要原因[8，10，11］．研究丙烯酰胺继续从动物进行给人类。血液采集方法也得到了发展，使拍摄对象可以更舒适。干燥血点（DBS）biosampling方法是一种新集中发展方法，并且它具有诸如收集过程的几个优点是相对容易的，需要的血液只有小体积，并且是微创以允许研究对象的舒适感;即在DBS纸张吸收在基体中分析物往往是在室温下稳定，使得它可以被存储和分布容易[12］．

在本研究中，研究对象为有或无吸烟记录的肺癌患者。本研究旨在了解两组丙烯酰胺水平是否存在差异。然后将肺癌患者组与阴性空白组进行比较。对DBS中丙烯酰胺的分析以前从未做过。因此，本研究采用已开发和验证的生物分析方法，采用LC-MS/MS在DBS中进行丙烯酰胺分析[13］．

2。材料和方法

2．1.参考标准样品和材料

丙烯酰胺和普萘洛尔购自Sigma-Aldrich(新加坡)。甲酸，乙腈HPLC级，和用于分析的甲醇从默克公司(达姆施塔特，德国)获得。PerkinElmer 226论文来自PerkinElmer (Waltham, USA)。

２.２.溶液和标准的准备

将10 mg AA溶于10 mL超纯水中，得到浓度为1000的AA原液μ克/毫升。将原溶液稀释至100度，得到中间溶液μ克/毫升。用超纯水稀释中间溶液制备工作溶液。用全血稀释工作溶液制备校准样品，得到浓度范围为2.5-100的一系列工作溶液μ克/毫升。AA质量控制样品分别用相同的程序制备，工作液浓度为7.5μ50 g / mL,μ克/毫升，和75 μg/mL用于低、中、高质量控制(QCL、QCM和QCH)。心得安原液在甲醇中制备，浓度为1000μ克/毫升。用甲醇稀释中间溶液，得到浓度为10的工作溶液μ克/毫升。

２.３.样品制备

血液样品经AA工作液稀释，得到浓度在2.5-100范围内μ克/毫升。每个浓度被发现多达30 μ然后在室温下烘干2.5小时。晾干后，纸被切成两段，放进管子里。然后，内标溶液加入100μL (10μg/mL普萘洛尔溶液)和500μL甲醇。搅拌1分钟，超声5分钟。4 015 g离心1分钟，400 gμL of the supernatant was evaporated at 40°C with pressure 8 psi for 20 minutes by a vacuum equipped with nitrogen gas. The residue was reconstituted with 100 μL流动相0.1%甲酸水溶液在水和乙腈(40:60)中超声20分钟。样品旋转30秒，737 g离心3分钟。然后,70年μ将L的上清液插入一个小瓶中，最终混合10μL注入LC-MS/MS系统。

２.４.质/女士

采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱(1.7μ米，100 mm × 21 mm). Acrylamide analysis used a mobile phase of 0.1% formic acid and acetonitrile with gradient elution. The electrospray ionization (ESI) source was operated in a positive mode with a multiple reaction monitoring (MRM) type. The MRM transition of the precursor to product ion pairs was米/zof 71.99 > 55.23 for AA and米/z内标为普萘洛尔260.16 > 116.04。Capillary voltage used is 3.50 kV with 50 V cone voltage. Desolvation temperature, gas flow rate, and gas cone source flow rate were set at 400°C, 650 L/h, and 1 L/h. The inlet voltage for acrylamide and propranolol is 26 V and 35 V, respectively. The voltage in the collision chamber for each compound is 8 V and 18 V. The injection volume used is 10 μL.

2．5．方法验证

验证分析是基于食品和药物管理局(2013)和欧洲药品管理局(2011)生物分析验证指南进行的[14，15］．

2.6。选择性和特异性

通过分析空白全血和DBS纸上标上AA和IS(内标)的空白全血，评价其选择性和特异性。评估使用了来自不同科目的至少6个矩阵。内源性成分的峰面积应小于LLOQ峰面积的±20%，小于IS峰面积的±5%。

2.7。线性

空白样品、零样品和八种浓度的AA(2.5、5、7.5、15、37.5、50、75和100)μg/mL)，并在DBS卡上标记标定曲线。通过绘制AA和IS峰面积之间的峰面积比来分析每个样品。每个浓度重复三次，用相同的程序进行分析。校准曲线是可以接受的,如果非零校准器±15%的名义集中在每个验证运行除LLOQ±20%的名义在每个验证运行和75%浓度和至少六个非零校准器水平应该在每个验证运行符合标准。

2.8。准确度和精密度

对来自质量控制库的四种浓度(LLOQ、QCL、QCM和QCH)的准确性和精密度进行了分析。日内和日间评估共进行5次重复，除LLOQ为20%外，需要%方差系数(%CV)±15%，准确度(%diff)应为±15% (LLOQ为±20%)。

2.9。复苏

回收率通过分析全血中的QC样品和在空白全血样品中添加分析物后提取三种浓度(QCL、QCM和QCH)来计算。比较各浓度下QC样品的峰面积比与萃取后添加分析物样品的峰面积比，得到%回收率。对于每种浓度，上述步骤重复三次。当% CV为±15%时，回收率是可接受的。

2.10。基体效应

基体效应是通过比较工作标准溶液和，将其用在两种浓度（QCL和QCH）分析物掺入拔牙后空白全血样品之间分析物的峰面积进行评价。The %CV of the ME should not be more than ± 15%. The standardized matrix factor values with the internal standard should obtain the acceptance range of 0.80 to 1.20.

2.11。结转

采用定标后的空白样品按定量上限进样评价结转率。测量的峰面积不应大于定量下限(LLOQ)下分析物峰面积的20%和内标物峰面积的5%。

2.12。稳定

丙烯酰胺和普萘洛尔的贮存液稳定性在室温(25°C)下短期评估(0,6,24小时)，在储存温度(−20°C)下长期评估(0,7,14,21和28天)。测试分三次重复进行，%差异值不应大于10%。在短期储存(在室温下保存0,6,24小时)和长期储存(在冰箱(−20℃)保存1,10,15天后)后，通过分析QCL和QCH来测试样品的稳定性。自动进样器的稳定性还通过分析QCL和QCH(在自动进样器温度下保持0和24小时)进行测试。试验分3个重复进行，%diff和%CV值不大于15%。

2.13。方法的应用

这项研究已与数030 / KEPK / III / 2019获得来自Dharmais肿瘤医院的健康研究道德委员会的伦理审查。干血斑从18名患者组成的6名肺癌患者与吸烟记录和12名肺癌患者无吸烟记录收集。采血通过用无菌采血针头刺破手指来完成。The blood that has been taken was then collected in a 0.5 mL K_3.EDTA真空采血管。在那之后,30μL血立即在DBS纸上标记，室温干燥约2.5小时。干燥的DBS样品被保存在一个密封的袋子里，里面装有干燥剂，直到分析时间。

对有吸烟史和无吸烟史肺癌DBS样本丙烯酰胺分析结果进行数据处理。利用线性回归方程计算丙烯酰胺水平。然后，利用独立样本进行统计检验t-测试和曼-惠特尼测试，以查看组间是否有显著差异。

3.结果与讨论

3．1.色谱系统和样品制备

在该研究中，LC-MS / MS与三重四极型质量分析仪和多重反应监测（MRM）质谱模式一起使用。MRM用于MRM，因为它非常适合于对复杂矩阵（如DBS）的分析中使用。使用的流动相是0.1％的甲酸和乙腈，梯度洗脱曲线如表所示1．采用梯度洗脱，总分析时间为3分钟。空白、零、LLOQ、QCL、QCM、QCH色谱图如图所示1．样品中分析物的色谱图如图所示2．

制备方法是分析中非常重要的方法，特别是DBS样品中含有大量全血成分的杂质，会干扰化合物的分析。因此，需要合适的制备方法才能将分析物从基质中分离出来。对DBS纸上的血斑体积和提取方法的各步骤进行优化，得到如上所述的样品制备方法。与SPE、LLE等样品制备方法相比，沉淀蛋白技术具有快速、简单、适用于高通量筛选等优点。

３．２．方法验证

在之前的研究中，在同一实验室进行了完全验证分析。通过绘制峰面积比(y)与内标准物的标称浓度(xAA)。在2.5 ~ 100.0的浓度范围内线性关系良好μ为AA g / mL。如表所示2，对LLOQ和QC样品（QC，QCM和QCH）进行的和间介的精度和准确性实验满足了EMA和FDA的要求，除非平均值，否则平均％差异和％偏差要求不超过±15％LLOQ％差异浓度不超过±20％。在运行范围内，运行不适应之间分别在1.89至7.07％和4.12至9.51％的范围内。运行中的准确性和运行之间的准确性估计为％偏见6.12至10.35％和9.88至11.73％。LC-MS / MS方法应排除任何矩阵效果。与溶剂中的标准溶液的面积相比，通过在坯料萃取过程中添加的分析物区域之间的分析显示了基质的效果。该方法显示可接受的基质效果，范围为96.33至105.68％，可变性（CV）为10％以下。以95.51％，84.61％和90.61％的百分比获得回收率，％CV 0.68％，1.56％和0.68％。恢复数据显示在表中3.．

３．３．DBS样品中丙烯酰胺的分析

所有样品使用上述验证的方法进行分析，并计算AA的浓度。无吸烟记录肺癌患者、有吸烟记录肺癌患者、阴性空白患者的AA水平曲线图结果如图所示3.．总体上，丙烯酰胺水平最低和最高分别为2.042μ克/ mL和12.70 μ克/毫升。肺癌患者与吸烟记录的平均的7.64丙烯酰胺含量的 μg/mL，无吸烟记录者丙烯酰胺平均水平为6.6μ克/毫升。独立样本t-检验结果显示，有吸烟记录与无吸烟记录患者AA水平无显著性差异。有吸烟记录的肺癌患者在不同的时期都停止了吸烟。除了吸烟之外，生活方式(饮食习惯)和吸烟环境也是AA的来源。暴露于AA可能来自含有AA的食物，香烟烟雾，甚至饮用水，所有这些都是人的日常消费。肺癌患者的饮食习惯数据见表4．SK07的DBS中含有丙烯酰胺的最高浓度为12.07μ克/毫升。根据调查问卷获得的数据，SK07是食用含丙烯酰胺食物最多的患者，而且在家庭和工作场所环境中多年被动吸烟。SK05 DBS中AA最低浓度为2.042μ克/毫升。这与从问卷中获得的数据一致，SK05是摄入含丙烯酰胺食物最少的患者，并且是非被动吸烟者。

AA被机体吸收后，会被CYP2E1代谢成其代谢产物，因此AA的代谢率受到该酶活性的强烈影响。根据Pelle的研究[16]，无吸烟记录的肺癌患者AA高水平也可能与多态性有关，t等位基因rs2480258可降低CYP2E1的功能活性，从而影响人体AA代谢率。无吸烟记录肺癌患者和有吸烟记录肺癌患者AA水平曲线图结果如图所示4．

然后对肺癌患者的丙烯酰胺水平进行Mann-Whitney测试，并与没有癌症疾病、丙烯酰胺食物摄入量极少的阴性空白患者进行比较。分析结果( ）肺癌患者丙烯酰胺水平与阴性对照有显著差异。肺癌患者组与阴性空白组丙烯酰胺水平分析如图所示5．

4.结论

采用LC-MS/MS对DBS样品中丙烯酰胺和普萘洛尔进行定量分析，LLOQ为2.5μ克/毫升。肺癌患者的AA水平为2.041μ12.702 g / mLμ克/毫升。独立样本t以及结果( ）显示，肺癌患者是丙烯酰胺含量与不吸烟的记录并没有显著差异。Mann-Whitney检验结果（ ）肺癌患者丙烯酰胺水平与阴性对照有显著差异。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了印尼大学研究和社区服务理事会(DRPM)的资助，资助编号为NKB-0480/UN2.R3.1/HKP.05.00/2019。作者还承认，Dharmais癌症医院在抽样过程中促进了研究对象的可用性。

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