胰腺癌患者的eno1过度表达及其临床和诊断意义

抽象的

我们研究了该研究，研究了PDAC患者组织和血浆中ENO1的表达，以评估其临床病理和诊断意义。在人PDAC和相邻的非癌症组织的组织微阵列中检测ENO1蛋白表达。进行电化学发光免疫测定和扩增的发光邻近均匀测定（alphalisa）以测量来自PDAC患者和健康对照的血浆中的Ca19-9和eno1浓度。我们证明ENO1过表达与临床阶段，淋巴结转移以及PDAC预后差相相关;ENO1可以用作PDAC诊断中的CA19-9的有希望的候选诊断标记。

1.背景

近年来胰腺癌（PC）的发病率迅速增加，目前男女对癌症死亡的第四个主要原因[1那2］．大多数PC是胰腺导管腺癌（PDAC），其特征在于晚期呈现。所有阶段的PDAC的五年存活率小于5％。这种预后差与诊断时的晚期疾病阶段有关，可能会通过早期检测来缓解[3.那4.］．

CA19-9是一种广泛用于诊断PC的传统肿瘤标志物;然而，CA19-9诊断PC的敏感性和特异性并不令人满意。CA19-9属于Lewis组的血脂，具有Lewis-负表型的个体无法合成CA19-9。大约5-10％的人口是Lewis阴性，这可能导致PC患者CA199的假阴性结果[5.］．此外，CA19-9是一种胃肠道肿瘤相关抗原，与胃癌，结肠直肠癌，安瓿癌，肝细胞癌和脱胸腺胆管癌相关联。在一些良性病变中也观察到Ca19-9的轻微增加，伴随着肝炎和急性胰腺炎等胆管梗阻[6.那7.］．因此，迫切需要寻求新的肿瘤标志物，以改善PC诊断。

烯醇酶，也称为丙酮酸脱氢酶，是催化2-磷的脱水的关键糖酵解酶 -D.- 甘露出至磷酸胆酚。已经表明，Enolase 1（EnO1）可能在肿瘤发生，癌症侵袭和转移中发挥重要作用[8.-12］．在我们以前的研究中，我们在7,12-二甲基苯并丙烯（DMBA）诱导的胰腺上皮内瘤（PANIN）和PC的大鼠模型中显示出对大鼠大鼠模型的显着上调，使用蛋白质组学工具[13］．一些其他研究还证实，在PDAC细胞系中mRNA和/或蛋白质水平上调节ENO1，并且可以在PDAC患者的外周血中检测ENO1 IgG抗体[14-17］．这些结果表明ENO1可能具有潜在的值，以成为PC诊断的新型肿瘤标志物。

在本研究中，我们研究了eNO1在人类PDAC和相邻的非癌组织中的差异表达，以及PDAC患者的外周血和健康对照，探讨其临床病理意义，以及肿瘤标志物单身或结合诊断价值CA19-9。

2.材料和方法

2.1。标本

含有31对人PDAC和相邻的非癌症组织的组织微阵列（上海超越Biotech有限公司，OD-CT-DGPAN03-002,19 MALES和12雌性）用于IHC染色。根据美国癌症（AJCC）的胰腺癌TNM分期系统（AJCC）的第七版，所有病例均按第七版进行阶段[18]包括4阶段I，4阶段和23阶段III。将样品甲醛固定并嵌入石蜡中。

从2012年10月到2014年10月到2014年10月收集了73名PC患者的血液样本，并在2015年10月，在2015年10月，在上海焦彤大学医学院上海市九人民医院胃肠学系。该病例由43名男性和30名平均年龄组成68.3±11.5岁的雌性组成。所有病例均通过操作，内窥镜超声引导的细针抽吸（EUS FNA）或内窥镜逆行胆管痴呆（ERCP）进行分类为PDAC。当收集样品时，对患者进行了无疗化疗，放疗或手术。患者，TNM分类11,19,27和16名患者分别分别为阶段I，II，III和IV。在同一时期内，没有消化系统疾病或肿瘤史的五十个健康病例被纳入正常对照（NC），其中27例雄性，23例女性，平均年龄为63.6±6.96。PDAC和NC集团之间的性别和年龄没有显着差异（ ）.

在含有EDTA抗凝血剂的真空血管中收集血液样品，在室温下用3500rpm离心15分钟，持续30分钟。在使用前将血浆样品储存在-80℃。本研究由上海交通大学医学院上海九人民医院伦理委员会批准。所有患者和健康对照的信息和授权使用血液样本。

2.2。免疫组织化学（IHC）染色

将组织微阵列依次在二甲苯和醇中脱硅氧化，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤三次。将内源过氧化物酶活性在PBS中包含3％过氧化氢10分钟，然后将部分与0.05％胰蛋白酶在37℃下孵育30分钟。在用PBS洗涤三次洗涤后，在37℃下用蛋白质嵌段封闭非特异性结合30分钟。然后将该片在4℃下用抗eno1抗体（Wh0002023m1，Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo，USA）孵育过夜，以1：400稀释。DAB（1：50）被用来检测ENO1蛋白质在核细胞的核和细胞质中沉积棕色反应产物。与PBS孵育的部分代替抗eno1抗体作为对照。使用两个半定量测量的盲观察者进行IHC染色：染色强度（0-4）和染色细胞的百分比（0 =无染色，1 =小于25％，2 = 25％-50％，3 = 50％ -75％，4 = 75％-100％）。将合并的IHC评分作为染色细胞染色强度和百分比的产物计算。

２.３.血浆中CA19-9和ENO1的定量测定

使用定量电化学发光免疫试剂盒在Roche e601系统(Roche Diagnostics, Mennheim, Germany)上测定血浆中CA19-9的浓度。所有程序都按照制造商的说明进行。

如前所述，通过扩增的发光邻近均相测定（alphalisa）方法测定eno1的血浆浓度[19那20.］．Sigma-Aldrich（ST.LOUIS，MO，USA）获得抗ENO1单克隆抗体（WH0002023M1，SAB1403772）和多克隆抗体（AV34376，E2659）。Alphalisa Reagents（PerkinElmer，W​​altham，Ma，USA）由alphalisa未缀合的受体珠（6772001），链霉抗生物素蛋白供体珠（6760002s）和alphalisa免疫测定缓冲液（AL000C）组成。在96孔的光学液中进行alphalisa测定，并在Enspire中读取^TM值Multilabel Plate Reader（PerkinElmer，W​​altham，Ma，USA）。

2.4。统计分析

使用IBM SPSS统计数据19（IBM，Armonk，Ny，USA）分析了数据。Chi-Square测试用于确定PDAC和相邻的非癌症组织之间的ENO1表达差异。Wilcoxon Rank-Sum试验和双侧试验用于对组之间的ENO1和CA199等离子体水平的成对比较。通过Spearman的相关分析评估了血浆eno1水平和PDAC组中患者特征的相关性。为了探讨PDAC的eno1表达和预后的相关性，使用外周血中的血浆eno1浓度的中值作为截止值，使用Kaplan-Meier方法进行分析的存活数据，进行对数秩检验进行比较。利用逻辑回归分析来绘制接收器操作特征（ROC）曲线。计算曲线（AUC）下的区域以比较不同生物标志物作为诊断测试的性能。 被认为表明了统计学上的差异。

结果

3.1。eNO1在PDAC患者的组织和血浆中上调

将ENO1的表达在PDAC组织微阵列中的PDAC和相邻的非癌症组织中进行了比较。IHC染色表明，核和细胞质中ENO1的表达水平较高，但膜中较弱（图1（a））.enO1的表达在人类PDAC组织中显着增加（ ），在人PDAC组织中，eno1 IHC得分为12.34±2.79，相邻的非癌症组织中的7.26±3.31（图1（b））.与正常对照相比，在73个PDAC患者的血浆中也发现了eno1浓度的上调。PDAC基团中的烯浓度为33.08±22.87ng / ml，其在正常对照组中显着高于其浓度为10.40±9.41ng / ml（ ） （数字2（a））.

3.2。组织和血浆的eNO1表达与PDAC发育有关

结果表明，PDAC患者组织和外周血中的eno1水平与原发性肿瘤的区域发展有关。在组织微阵列样品中的PDAC组织的不同阶段中，ENO1 IHC评分从9.25±0.87（Ⅰ阶段I），12.5±2.52（阶段II）增加到12.85±2.76（III阶段）（ ） （数字1（c））.检测到不同PDAC阶段的血浆ENO1水平如下：19.03±3.66ng / ml阶段I，30.26±4.18ng / ml阶段II，61.74±15.86ng / ml阶段III，31.72±5.35ng / ml第四阶段。外周血的eno1浓度与PDAC阶段具有阳性关系，因为血浆eno1在阶段II，第III期和阶段IV中增加，与阶段I相比，阶段I和第III期之间只观察到显着差异（ ） （数字2（b））.进一步分析发现，淋巴结转移组的ENO1水平(9.23±4.68 ng/ml)高于无淋巴结转移组(6.51±4.69 ng/ml) ( ）.eNO1水平与PDAC位点之间没有相关性，肝转移等肝转移，​​患者的年龄和性别，以及糖尿病。

3.3。血浆eno1水平与PDAC患者的预后有关

结果表明，升高的血浆eno1水平与PDAC患者的预后不良有关。当使用27.8ng / ml的截止值时，PDAC患者的中位存活时间较高的eNO1水平（> 27.8ng / ml）小于eNO1水平降低（≤27.8ng/ ml）的PDAC患者（ ） （数字3.）.PDAC患者的中位生存时间为18.66±2.43个月（95％置信区间（CI），13.91-23.42个月，浓度下降（≤27.8ng/ ml）;相比之下，中位存活时间减少至15.62±2.44个月（95％CI 10.83-20.41个月），具有较高的ENO1水平（> 27.8ng / ml）。

3.4。ENO1单个或与CA19-9结合PDAC的诊断值

因此，生成ROC曲线以研究ENO1单身的诊断值或与CA19-9联合PDAC。Ca19-9的曲线（AUC）下的区域为0.869（95％CI 0.791-0.929; ）.当使用37u / ml的Ca19-9浓度作为区分PDAC的截止时，诊断PDAC的敏感性和特异性分别为78.1％和94.0％。eNO1的AUC为0.817（95％CI 0.738-0.895; ）.当使用27.8ng / ml的中值浓度为27.8ng / ml时用作截止诊断PDAC的截止值，诊断的敏感性和特异性分别为75.8％和88.2％。CA19-9和ENO1组合的AUC为0.935（95％CI 0.889-0.980; )，双标记板的敏感性和特异性分别提高到94.5%和82%(图4.）.

此外，在所有73名PDAC患者中，血浆CA19-9水平在15名PDAC患者的正常范围内。在这15名患者中，用酶水平的酶水平鉴定了高于所提出的参考值≤12.88ng/ ml的血浆水平。

4。讨论

在大多数名为Warburg效应的大多数肿瘤细胞中增强了糖酵解[21.]但虽然糖酵解代替三羧酸循环产生超过50％的能量，即使在氧气存在下也会产生三羧酸循环。通过重新编程代谢程序，肿瘤细胞可以通过更高的葡萄糖吸收和生物大分子合成来实现快速增长，以增强糖酵解途径[22.］．ENO1，也称为α-烯醇酶，是催化2-磷的转化率的关键糖酵解酶D.- 甘露出至磷酸丙酮化物[9.那16］．已知糖酵解途径中的基因已发现在一组癌症中过表达[23.那24.］．ENO1作为糖酵解途径中的代谢酶，本研究证实在人PDAC组织和血浆中表达显著增加。其他研究也表明，在PDAC细胞株和动物模型组织中，ENO1在mRNA和/或蛋白水平上表达上调[13-15］．

最近的研究表明，ENO1在若干生物和病理生理过程中起重要作用[15那16那25.]，如肿瘤发生，癌症侵袭和转移[26.那27.］．ENO1也是免疫疗法的潜在目标，据报道，小鼠抗人生烯酮单克隆抗体抑制人PDAC细胞的侵袭性[15］．在大多数情况下，ENO1是一种细胞质蛋白，但也可以在细胞膜或核DNA结合蛋白的形式表达，表明ENO1是多官能酶。在细胞质中，ENO1通过调节细胞的繁殖并保证细胞的存活和对其生理功能的生存来保持细胞的ATP水平。另外，位于细胞质中的ENO1可以与细胞骨架系统和其他代谢酶相关联，以促进肿瘤细胞运动。本地化在细胞膜上的eno1可以作为纤维蛋白可溶性纤溶酶原受体激活纤溶酶原体系，并且通过地下室膜和细胞外基质重塑来促进癌细胞的侵袭和转移肿瘤细胞[14］．此外，名为C-Myc启动子结合蛋白-1（MBP-1）的核DNA结合蛋白也由eno1基因编码，该基因主要位于核中，与C-myc p2启动子结合，以负调节c-myc表达和抑制肿瘤生长[28.］．

因此，应该合理的是，eno1具有潜在的值，以成为PDAC诊断的肿瘤标志物。虽然eNO1被认为是使用细胞系和组织中的蛋白质组学的潜在肿瘤标志物[29.-32.]，对PDAC患者外周血的研究较少。ENO1可通过肿瘤细胞坏死、周转或外泌体等非经典分泌途径进入外周血。先前的研究证明，在体液中检测ENO1是可行的[33.]，但我们发现目前商品化的ENO1酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒很难检测到ENO1，因为它在外周血中的浓度非常低。因此，我们选择AlphaLISA方法检测PDAC患者外周血中的ENO1。AlphaLISA技术是一种基于珠子的方法，依赖于供体珠子和受体珠子之间的相互作用。当抗体-抗原反应导致供体珠和受体珠相互靠近时，激光激发级联反应，产生大大放大的信号[19那20.］．alphalisa方法显着提高了检测的灵敏度，具有明显的优点，可用作在外周血中发育ENO1检测的强大测定方法。

我们的结果显示，在PDAC患者外周血及PDAC组织中，ENO1水平与肿瘤进展呈正相关，提示ENO1浓度可能与局部肿瘤及血管浸润有关。在III期达到峰值后，IV期肿瘤的ENO1血浆表达水平明显低于III期肿瘤，但差异无统计学意义。这可能与开始于PDAC最早期肿瘤阶段的ENO1上调有关[13]，随着PDAC的发育而增加，通过最新阶段的坏死和原发性肿瘤细胞的坏死和周转血液中的外周血下降。IV阶段癌症未包含在我们的组织分析中，因为IV阶段患者大多不能接受手术以收集肿瘤组织。此外，ENO1水平与淋巴结转移和PDAC的预后密切相关。eno1浓度较高的患者的存活时间明显短于eno1浓度下降，这表明浓度较高的PDAC患者应以较短的间隔重新检测以检测再现和转移。我们的结果与一些额外的研究一致，即ENO1水平与高度的恶性肿瘤和预后差相比正相关[34.-36.］．

我们的结果表明，ENO1可用作PDAC的有希望的诊断指标，ENO1和CA19-9的组合可以提高诊断准确性。当27.8ng / ml ENO1用作截​​止的截止值以诊断PC时，诊断的敏感性和特异性分别为75.8％和88.2％，并与CA19-9的组合改善为94.5％和82％，这比CA19-9的敏感性（70-84.9％）[5.］．注意，ENO1的敏感性和特异性几乎接近Ca19-9，与eno1或Ca19-9相比，eno1结合Ca19-9的敏感性得到改善。此外，我们发现，eno1的血浆浓度在15名PC患者中，具有正常的Ca19-9水平的患者超出了≤12.88ng/ ml的提出的参考值，对于Lewis阴性表型的PDAC患者，具有正常的Ca19-9水平，当检测到高水平的ENO1时，它需要小心。

随着我们包括健康的参与者作为控制，我们的研究似乎很好，但它不足以区分PDAC与其他肿瘤。已经表明，在乙型肝炎病毒相关的肝细胞癌患者中，ENO1表达在肿瘤组织中增强，特别是对于肝细胞癌不良并且与肿瘤大小和血管受累密切相关[34.］．ENO1的过表达与非小细胞肺癌的临床阶段和复发相关[30.］．在头部和颈部癌症中，eno1表达升高的患者患有较差的临床结果，包括比具有较低表达的总体和无进展存活率更短的临床结果[35.］．eno1 mRNA水平的表达增加与乳腺癌大小和淋巴结转移呈正相关，但与无病间隔负相关[36.］．胆管癌患者肿瘤组织中ENO1高表达，与腹膜淋巴结转移及预后呈正相关[37.］．因此，应在未来的研究中探索一个重要的解决方案是如何将ENO1与CT或MRI组合以改善诊断特异性和本地化。由于患有慢性胰腺炎的患者患有慢性胰腺炎的患者，作为PDAC的良好诊断工具，对于慢性胰腺炎患者存在良好的诊断工具，至关重要。尽管之前的研究表明，在慢性胰腺炎组织中没有上调eno1 mRNA的上调表达，类似于正常胰腺组织[14[未来的研究，我们还将另外评估酶作为慢性胰腺炎和PDAC患者的区分诊断标志物的血浆水平。

结论

eno1的上调水平与Pdac的疾病进展和预后呈正相关。ENO1可以用作PDAC诊断中的CA19-9的有希望的候选诊断标记。

缩写

alphalisa：	扩增的发光邻近均匀测定
DMBA：	7,12-二甲基苯并蒽.
eno1：	enolase 1.
ercp：	内窥镜逆行胆管胆胆痴呆
eus fna：	内镜超声引导的细针吹口
包含IHC:	免疫组织化学
MBP-1：	C-myc启动子结合蛋白1
帕林：	胰腺上皮内肿瘤
PBS：	磷酸盐缓冲溶液
个人电脑：	胰腺癌
PDAC：	胰腺导管腺癌。

伦理批准

在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序都符合机构和/或国家研究委员会的道德标准，并符合1964年赫尔辛基宣言及其后来的修订或类似的道德标准。

同意

该研究中包括的所有参与者发出知情同意书。

利益冲突

作者Hang Yin宣称她没有利益冲突。作者雷旺宣布他没有利益冲突。作者海林刘宣布他没有利益冲突。

作者的贡献

杭尹和雷王是这项工作的联合第一作者。

致谢

本研究由上海科技委员会资助（授予No.:114119B1500和15140904100）。

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