比较多重PCR和快速尿素检测检测幽门螺旋杆菌使用质子泵抑制剂的患者

抽象的

背景．本研究旨在评估多重PCR检测的诊断价值幽门螺旋杆菌进一步评估有无PPI治疗的患者CLOtest阴性结果。方法。这项研究是一项回顾性队列研究，包括457名有消化不良症状的患者，他们于2003年6月至2007年10月在埃文斯顿和格伦布鲁克北岸医院接受了上内窥镜检查。总共报告了556个样本，其中一些患者在一段时间内进行了不止一次检测。首先对胃标本进行CLOtest，从该标本中分离DNA并进行一步多重PCR。结果．通过M-PCR测试,幽门螺旋杆菌在对照组的143例（52.2％）中检测到对照组的274例，130例（46.1％）的PPI治疗患者282例（）。克罗斯特检测到存在幽门螺旋杆菌在同一组282例接受PPI治疗的患者中有4例(1.4%)，在未接受PPI治疗的患者中有29例(10.6%)。）。结论．我们的PCR足够灵敏，可以检测到幽门螺旋杆菌尽管存在PPI治疗。

1。目的

幽门螺杆菌（幽门螺旋杆菌)是一种螺旋状细菌，主要存在于胃中。1］．细菌在胃炎，胃癌，胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和消化性溃疡病中具有显着的致病作用[2］．世界卫生组织分类幽门螺旋杆菌作为I类癌症[3.];这是一个主要问题，因为世界上大约一半的人口被感染了幽门螺旋杆菌[4.］．

目前，有许多测试可用于识别幽门螺旋杆菌，但没有金标准。快速脲酶测试（RUT）广泛用于临床实践以检测脲酶酶幽门螺旋杆菌在胃粘膜活检中。脲酶将尿素水解成二氧化碳和氨允许幽门螺旋杆菌在酸性介质中生存[2那5.］．通常认为酸还原药，特别是质子泵抑制剂（PPI），降低车辙，尿素呼气试验，组织学和粪便抗原测试的敏感性和准确性通过减少量幽门螺旋杆菌[6.那7.］．

质子泵抑制剂可降低幽门螺旋杆菌并将它们的分布转移到近端。研究表明，PPIs抑制生长幽门螺旋杆菌通过ph相关的机制。质子泵抑制剂在诊断试验中可能导致假阴性，应在进行试验前至少停药2-4周[8.那9.］．然而，这产生了一个问题，因为PPI退出与症状复发密切相关。而在PPI上，RUT为阴性不足以排除感染。活检标本可能含有活细胞的低细菌密度，导致阴性结果。这成为一个问题，因为许多美国人正在服用这些药物。2009年，PPIs在美国的销售排名第三，处方总数排名第六[10.］．在几项研究中，作者得出结论，PPI降低了对RUT和组织学检查的胃窦和语料检查活检的敏感性和特异性。聚合酶链反应（PCR）在检测方面更敏感幽门螺旋杆菌．Yakoob等人。表明PCR比采用PPI的患者的RUT和组织学更敏感[7.那11.那12.］．然而，单基因PCR的问题仍然缺乏理想的特异性和假阳性。随着酸还原药物对许多诊断试验的影响幽门螺旋杆菌，DNA的突变率和当前PCR方法测试1或2个基因，我们开发了一种独特的多重PCR（M-PCR），可检测5个独特的基因，改善特异性。

在我们进行的先前研究中，我们独特的M-PCR准确地识别幽门螺旋杆菌与Rut和免疫组织化学分析相比;除了识别大量的幽门螺旋杆菌前方法不会检测到的感染[13.-15.］．本研究的目的是确定PPI对RUT和M-PCR结果的影响。我们假设由于M-PCR技术的敏感性和DNA的稳定性，M-PCR不会受到PPI的生理变化的影响。

2.方法

2.1。耐心

本研究是一种回顾性群组，其中包括457名患有457名患有的消化不良患者，他于2003年6月至2007年6月在埃文斯顿和格伦布鲁克西北部医院接受了上内窥镜检查。活检在胃窦和体内服用。该研究基于全面的图表审查分为两组：第一个组是在PPI上，对照组不在PPI上至少四周。那些服用H.₂- 在过去4周内，在内窥镜检查中被排除在两组内的拮抗剂和抗生素。知情同意是从每位患者获得的，并由Evanston Northwestern Health Care制度审查委员会审查和批准该研究。

2.2。快速尿素测试（CLOTEST）

根据制造商的说明，首先在所有胃标本上首先在所有胃标本上首先进行克罗斯特快速尿素测试（Kimberly-Clark，Roswell，Ga）。需要一个明确的洋红色颜色来将测试视为阳性。结果在20分钟后解释，然后24小时后被解释。

2.3。多重PCR.

读取CLOtest后，将相同的标本送到实验室分离DNA。然后进行一步M-PCR。评估M-PCR电泳凝胶的研究人员对CLOtest结果不知情。M-PCR的定位位点为:0.86 kb DNA片段、脲酶A基因、16S核糖体RNA、26-kDa蛋白抗原和hpaA基因。每个位点选择1条正向引物、普通引物(FC)和2条反向引物(R1和R2)。R2引物位于R1的放大区域内。将R1和R2引物分别与5条FC引物混合，分别设置在FC-R1和FC-R2引物扩增体系中(图)1）。在2个管中可以扩增10个DNA片段，每个DNA片段含有5个含有5个的扩增子。对于M-PCR，我们定义了一个积极的情况幽门螺旋杆菌如果由于细菌的高多样性的高多样性，则扩增来自相同轨迹的10种或两组DNA片段（图2）[13.-16.］．在每个M-PCR运行中，测定阳性（菌株J99）和阴性（水坯料）对照样品以确保有参考和没有污染。所进行的每个M-PCR含有阴性对照，其含有除胃组织之外的所有反应组分，以评估污染。此外，为模板制备，PCR反应和PCR后分析设置了三个物理上单独的工作场所，以避免污染。使用特殊的气溶胶移液管和常规UV和含酒精清洁。

2.4。统计分析

使用的统计包是图形Instat版本3.10。通过使用Fisher精确测试进行统计分析，2尾进行。P.小于0.05的值被认为是显著的。

3.结果

总共报告了556个样本，其中一些患者在收集数据的时间跨度内进行了不止一项测试。一项临床后记录回顾显示282例(50.7%)患者在内镜检查前服用PPI至少四周。

M-PCR测试的两组之间没有差异。通过M-PCR测试，幽门螺旋杆菌在对照组的143例（52.2％）中检测到对照组的274例，130例（46.1％）的PPI治疗患者282例（）。克罗斯特检测到存在幽门螺旋杆菌在同一组282例接受PPI治疗的患者中有4例(1.4%)，在未接受PPI治疗的患者中有29例(10.6%)。）。鉴定的M-PCR幽门螺旋杆菌34例CLOtest中有33例(97.1%)1）。

在PPI组和无PPI组中，CLOtest和M-PCR的检出率均有显著差异(）。M-PCR检测额外的241例（46.1％）的523例，克罗斯最负。特别是在PPI组中，检测到278（45.7％）中的127例额外的案例，检测到对照组中的245例（46.5％）中的114例。

4。结论

幽门螺旋杆菌是一种主要的人类病原体。因为不同的影响幽门螺旋杆菌，需要一种准确的检测方法。目前，还没有一种方法足够敏感和特异，可以被认为是“金标准”，所以我们不能使用一个标准进行比较;而是使用了在实践中通常使用的具有临床意义的方法。我们开发了一种独特的多重PCR检测方法幽门螺旋杆菌在内镜活检标本中。

这项研究已经证明PPIs影响幽门螺旋杆菌通过CLOTEST方法的检测率，但不是M-PCR。这是在选择诊断测试时考虑的重要因素幽门螺旋杆菌．另外，对CLOtest的阴性结果进行重新检测的结果也增加了46.1%。因此,幽门螺旋杆菌应仔细审查当前方法的测试，特别是最近服用PPI的患者，以确保结果不是假阴性。Clotest是高度特异性的，但需要高密度的细菌进行检测。M-PCR足够敏感以检测存在幽门螺旋杆菌尽管个人在PPI治疗中。

我们研究中M-PCR的高检测率可归因于我们的研究患者人口。我们只测试了症状的患者，这些患者更容易感染;结果，这些类型的患者的数字将更高。群体之间的检测率和低检测率差异的另一个来源来自组的形成的组织形式幽门螺旋杆菌．它可以存在于三个阶段：螺旋，可行的球型和退行性的不可行的球蛋白形式。可以通过各种条件，例如PPI和某些抗生素诱导的Coccoid形式[17.］．研究表明，在从螺旋到手球菌形式的转化过程中蛋白质含量和遗传物质保持不变。手式细胞的脲酶活性低于螺旋形式[18.］．难以鉴定车辙形式的难题;然而，PCR方法用于检测遗传物质，因为DNA保持完整。Can等人的研究。表明，由于未检测到突变的不同因素诱导，尿素基因区域的可靠性，因为未检测到突变[19.］．我们的假设通过先前的研究表明，我们的M-PCR能够检测到Coccoid形式中的DNA。球粒子形式可能不那么毒性，不太可能殖民和诱导炎症。然而，它可能在感染中发挥作用，并且怀疑是部分原因，抗菌治疗后感染的复发。当条件变得合适时，球巾形式可以恢复到螺旋形式，并可恢复感染率[18.］．

除了上述提到的药物，我们没有排除其他药物。任何增加pH值的药物或抗生素都能影响幽门螺旋杆菌因此可能影响结果。一名患者通过克罗斯特测试阳性​​，而M-PCR是阴性的。这种差异可能有几个原因;它可能是一个假阳性，其中克罗斯特是97％的特异性，或者产生酶细菌的不同释放酶或M-PCR由于基因突变而无法检测到细菌。在我们以前的研究中，所有阳性患者通过免疫组织化学分析和CLOTEST也通过胃样本中的M-PCR方法阳性[13.］．

我们的M-PCR阳性结果46.1%，PPI组和对照组分别为52.2%，与我们之前的研究相似，检测出52%的病例幽门螺旋杆菌从负面结果中额外40％。我们进行了一项盲化的研究，将M-PCR的检测率与炎症分数，免疫组织化学发现和克罗斯特结果相关联。M-PCR和CLOTEST结果是由检查组织学特征的独立病理学家知名的。该研究得出结论，在胃活组织检查标本中，PCR阳性的平均活动和慢性炎症评分明显大于PCR阴性，显示出存在幽门螺旋杆菌．在胃活组织检查标本中，检测到的M-PCR幽门螺旋杆菌在免疫组织化学分析和/或克罗斯特检测到的所有阳性病例中[13.］．

研究和研究结果与yakoob等人进行的先前研究的结果一致。该研究发现在PPI和对照组的基团之间的PCR检测速率没有差异，在胃窦中74％对75％。它还得出结论，减少了车辙和组织学的诊断产量，PCR比两者更敏感。在PPI组中，从antrum的活检，在PCR中74％，在车辙中18％，组织学中的50％阳性。此外，PPI组中还有68％，发现对照中的44％是PCR的阳性。与我们的研究相比，PCR的检测率较高，这可能是由于较小的研究人群，种族背景或病患者。此外，由于他们的研究使用一种基因与我们使用5基因的研究，检测率可能更高。该研究得出结论，与PCR和组织学相比，使用酸还原药的使用降低了车辙的诊断产量[11.］．在涉及传统PCR的大多数其他研究中，使用一种或两种基因来识别幽门螺旋杆菌．我们的M-PCR与所有其他研究不同，因为我们的M-PCR使用5个基因，因此更具体幽门螺旋杆菌．因此，可能难以将我们的M-PCR的结果与传统PCR相关联。

PCR技术用于检测微生物，包括幽门螺旋杆菌，有很好的记录。传统PCR方法的潜在问题包括由于各种物种中的污染和同源性DNA序列的误报。在我们的研究中，在非PPI组中的M-PCR和Clotest之间存在很大差异，可能代表误报[20.］．用于M-PCR的引物在美国国家生物技术信息中心的基因库中进行了扫描，没有发现匹配的引物。还有M-PCR幽门螺旋杆菌针对19种细菌物种进行了测试（大肠杆菌，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，肠球菌物种,凡里安人团体，铜绿假单胞菌、沙雷氏菌属物种,Klebsiella肺炎，MRSA，乳酸杆菌物种,citrobacter物种,脆弱拟杆菌(ATCC25285)、琥珀酸沃氏菌(ATCC29543)、空肠弯曲杆菌(ATCC33291)、白痢幽门螺杆菌(ATCC52802)、fennelliae幽门螺杆菌(ATCC35683)、幽门螺杆菌(ATCC35683)物种(ATCC35683)、heilmannii幽门螺杆菌(ATCC49286)、felis幽门螺杆菌(ATCC49179)）））。19个细菌中没有一个显示标准幽门螺旋杆菌M-PCR带状图案。还有一个内部控制来防止误报。我们的M-PCR同时扩增10个DNA片段以及将为五个基因座中的每一个生产的两个片段，另一个碎片。我们的一步多巢式PCR的内部控制用于排除在引物结合位点中的各种物种中的同源DNA序列引起的假阳性，使得M-PCR比传统的PCR更具体。同样如前所述，通过我们的研究验证了我们的M-PCR测试，表明我们的阳性M-PCR结果显示出明显更大的平均活动和慢性炎症评分。

非ppi组的RUT检出率较低。这可能是由于其他我们没有排除的减酸药物，如铋化合物或钙产品。虽然我们进行了全面的药物审查和调查，但患者可能没有透露全部信息。我们的检出率低于其他研究，但提到的其他研究的检出率也很低[11.那12.］．

总体而言，M-PCR检测到另外2​​41个阳性情况。如果患者从RUT患有阴性结果，我们的M-PCR已经证明在诊断中有用幽门螺旋杆菌为了进一步评估阴性结果，因为它不受酸还原药的影响。可以推荐使用M-PCR作为添加剂测试以确认存在幽门螺旋杆菌在RUT阴性的患者中此外，对于要求患者接受经验性治疗或维持治疗的临床医生，可以使用M-PCR检测，这样患者就不需要摘除PPI。该M-PCR检测鉴定了大量的幽门螺旋杆菌在RUT检测不到的感染中，发现了46.1%的阳性病例。我们的M-PCR幽门螺旋杆菌将提高检出率，增加医疗干预的机会，并允许患者通过敏感和特定的方法进行治疗，不像许多其他诊断方法那样受到PPI的影响。我们在美国开发了一种可供医生使用的M-PCR。

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