微环境因素参与胰腺癌肿瘤的发生发展

摘要

介绍．尽管多年来的深入研究，胰腺腺癌仍然是最致命的癌症之一。手术干预仍是治疗的主要可能性，因为化疗和放疗对长期生存的影响很小。我们仍在寻找这种破坏性疾病的薄弱程度。材料和方法．从36例患者收集胰腺肿瘤组织样品。免疫组织化学染色用于评估生长因子和免疫渗透的表达。通过Gelatin酶谱评估MMP2和MMP9的活性，在7.5％SDS-PAGE凝胶中评估了0.1％明胶。结果．所有生长因子均在胰腺肿瘤组织中表达强烈。我们发现G3肿瘤中c-Met受体的表达水平高于G2肿瘤。我们还发现，活跃的MMP2存在于肿瘤的所有阶段，而活跃的MMP9只存在于更晚期的肿瘤。肿瘤组织有丰富的免疫细胞浸润，特别是巨噬细胞浸润。我们发现巨噬细胞的数量与淋巴结转移有关。结论．在我们的研究中，我们发现在影响肿瘤微环境c-Met受体的诸多因素中，浸润性巨噬细胞和MMP2对胰腺癌的发生和侵袭有显著影响。

背景

尽管多年来的深入研究，胰腺腺癌仍然是最致命的癌症之一。手术干预仍是治疗的主要可能性，因为化疗和放疗对长期生存的影响很小。过去二十年的研究已经对胰腺癌生物学产生了许多深刻的见解，但它既没有改进诊断方法，也没有改善治疗方法。我们仍在寻找这种破坏性疾病的薄弱程度。

近年来研究表明，肿瘤微环境在肿瘤进展中起着至关重要的作用[1］．在胰腺中，这种微环境特别异质。它由具有癌细胞，星状细胞，渗透炎症细胞的致密纤维化基质和胰腺的遗骸组成。这些细胞是各种生长因子的来源以及常规因子。存在于肿瘤组织中的成纤维细胞负责生产胶原和纤连蛋白，其增加肿瘤的化学化。由于纤维化组织丰富，肿瘤环境强烈缺氧[2那3.］．所有这些因素都有助于疾病的侵袭性和早期转移的发生。

渗透炎性细胞是影响肿瘤生长，侵袭和转移的丰富因素来源。巨噬细胞特别感兴趣。近年来研究了他们在肿瘤环境中的作用[4.］．已知，它们是丰富的生长因子来源，如EGF, PDGF-BB, HGF等刺激细胞增殖α和tgf.．此外，它们还产生基质金属蛋白酶-9 (MMP9)，参与各种重要过程[5.］．

基质金属蛋白酶是一组20种蛋白酶，分为4个亚类:胶原酶，明胶酶，基质溶酶和膜型基质金属蛋白酶。它们参与细胞外基质的修饰，使其成为血管生成、细胞迁移和转移形成等过程的重要组成部分。它们还参与许多蛋白质的激活，通过这种方式它们可以调节增殖和凋亡[6.］．

MMP 2和9被分类为明胶酶。它们在转移形成中的作用是显着的，因为它们的基材是胶原蛋白IV，是基底膜的组分。其降解使得可以迁移癌细胞。在许多类型的癌症中陈述了MMP 2和9的表达增加。在乳腺癌中[7.它们的活性与远处转移有关，在食管癌的情况下，侵袭性增加[8.］．

同样在胰腺癌中，显示了MMP的强烈表达。在对6个细胞系进行的研究中，显示MMP2的增加表达和活性与胰腺癌细胞的更大的侵入性潜力相关[9.］．

我们的研究目的是研究可能影响肿瘤发展的三个点:生长因子的表达，炎症细胞的浸润，基质金属蛋白酶的酶活性，从而对胰腺癌肿瘤有更全面的了解。

2.材料和方法

2.1。患者和标本系列

本文收集了36例因胰腺癌行手术切除的患者的胰腺肿瘤组织样本。根据华沙医科大学生物伦理委员会批准的方案收集组织。根据TNM分期和肿瘤分级对肿瘤进行分类。PDAC患者T1 ~ t4 (T1 (），t2（），t3（）和t4（）），n0（），n1（), M0 (）和m1（)阶段。组织学分级:G1 (），G2（）和g3（)．

分离蛋白时，将样品冷冻并在−20°C下保存，直至使用。标本进行免疫组化分析，尺寸为mm在丙酮中使用干冰冷冻45秒，温度为−70°C，保存于−80°C。

2.2。凝胶Zymography

使用总蛋白质提取试剂盒（Millipore，Billerica，USA）从肿瘤组织中分离蛋白质。10. μg总蛋白从组织中分离出来，用2份Zymogram样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)稀释，并用含有0.1%明胶的7.5% SDS-PAGE (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)进行解析。电泳后，用2.5% Triton X-100洗涤凝胶，去除SDS两次，持续30分钟，并在显像缓冲液(50 mM pH 7.5 TRIS缓冲液，5 mM CaCl)中孵育₂和0.2 M NaCl)在37°C下处理20 h。用0.5%科马西蓝染色凝胶1小时，然后在脱色液(甲醇40%，醋酸10%)中孵育，观察明胶酶活性。然后用清水冲洗去除的凝胶。进行半定量评价，拍摄凝胶照片，使用MicroImage (Olympus, Japan)软件。

２.３.免疫组织化学

来自胰腺癌的冷冻组织被冷冻成5μ米的部分。每个组织用苏木精-伊红(H&E)染色。免疫染色采用Dako REAL EnVision检测系统、过氧化物酶/DAB+、兔/小鼠。室温干燥后，用丙酮固定10分钟。然后用双内源性酶阻断剂(Dako, Glostrup, Denmark)孵育5分钟。切片用合适的EGF (Z-19)、EGFR (EGF- r2)、PDGF-BB (N-30)、HGF抗体孵育25分钟α（H-145）和C-MET（C-12）（全部表达Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，USA）和CD68和CD3（EBM11; F7.2.38，Dako，Glostrup，Denmark）。然后与Dako Real Envision / HRP孵育，兔/小鼠（ENV）在室温下25分钟，然后使用Dako Real Dab +色原的颜色反应3分钟。幻灯片用Mayer的苏木精定位。

2.4。免疫组织化学染色的半定量分析

为了定量评估，在低功率40x下扫描肿瘤切片后选择5个区域。使用Microimage Software（奥林巴斯，日本）以200倍放大率分析这些字段，计算总染色区域。

2．5．统计分析

进行了比较：两组与Mann-Whitney用Kruskal-Wallis测试测试和三组。最小的意义程度被定义为．

3.结果

3．1.胰腺癌中的生长因子

免疫组化研究了25个肿瘤组织中生长因子的表达情况(图)1)．在所有情况下发现生长因子的表达。EGF的免疫反应性在癌细胞的细胞质中较弱至中度。至于EGFR，我们发现其表达在癌细胞的细胞质中适度至强烈，在小导管细胞中弱。PDGF-BB免疫反应性在癌细胞的细胞质中适度至强度，并且在6例中，我们发现癌细胞中的核染色以及渗透免疫细胞。HGF的膜质和细胞质染色α在肿瘤细胞中强烈，而C-Met的染色是中等的。

将生长因子的表达与肿瘤分级和N期进行比较。对所有考虑的生长因子表达进行半定量估计，统计分析结果显示，在c-Met受体()(图2)．

３．２．浸润炎症细胞

为了评估细胞浸润，我们使用针对CD68，HLA II，中性粒细胞弹性蛋白酶，CD3和CD56的单克隆抗体。我们发现众多淋巴细胞和巨噬细胞渗透。也存在嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的强烈表达。观察到NK细胞渗透。肿瘤腺体周围存在炎症细胞，并且在癌细胞浸润的神经中也强烈地存在（图3.)．

我们比较了N期的结果，发现淋巴结转移组(401)肿瘤组织中巨噬细胞的数量显著高于N0组(167)()(图4.)．

３．３．凝胶Zymography

在来自胰腺肿瘤的30个组织分离物中研究了Genolytic活性。活性MMP2（62kDA）存在于88％的88％和MMP9（83kDA）中，38％案例。对于6个样本，由于凝胶的模糊图像，我们无法确定MMP的活动。

根据组织学交易结果，G1肿瘤未观察到基质金属蛋白酶9活性。G2肿瘤7例(）案例和仅适用于4（)．要求活性MMP2的外观索赔3 G1案例（），在G2的所有样品中和10g3例（Z 11）。

密度计量测量还证实，对于良好分化的肿瘤基质金属蛋白酶的活性低于G2和G3（)．MMP2活性分别为G1: 3。；G2: 16。；G3:.2（)．没有报道MMP9的活性对于G1肿瘤，以及其它组分别为G2：；G3:．

4.讨论

在胰腺肿瘤中，我们观察了强烈的免疫细胞浸润。在胰腺癌中，据报道，巨噬细胞参与血管生成[10.]，支持肿瘤生长和侵袭癌细胞。它们是VEGF等血管生成因子的来源，也可以降低细胞外基质的MMP9。TDHE重要事实是巨噬细胞可以抑制T细胞反应。因此，渗透胰腺肿瘤的巨噬细胞是产生转移的重要因素。我们发现，巨噬细胞数量在淋巴结转移组中较高。该观察支持关于巨噬细胞参与创造转移的陈述。

丰富的生长因子表达是胰腺癌组织的典型。当他们参与受受体酪氨酸激酶介导的信号传导途径时，它们可能会调节细胞增殖，迁移和存活。以前关于表达增长因素的研究和有趣的观察。据报道，高水平的EGF和EGFR与淋巴结受累和远处转移以及中位生存期有关[11.］．只有在PDGF-BB血清高水平对预后有利的情况下[12.]肿瘤中的高表达与胰腺癌生长减少有关[13.］．在我们的研究中，我们观察到生长因子的强烈表达;然而，只有c-Met受体在G2组和G3组之间有统计学上的显著差异。在淋巴结转移方面没有观察到显著差异。

我们的结果表明c-Met可能是胰腺癌的关键因素。这种受体酪氨酸激酶被HGF激活在生理上它参与胚胎发育也参与成年期肝脏再生和伤口愈合[14.］．然而，在胰腺癌中，甚至在癌发生的早期，也观察到它的过表达[15.］．

c-Met活化导致增殖、运动性和侵袭性增加。因此，我们推测，在G2和G3阶段之间c-Met表达的增加表明更具有侵袭性的表型，这可能与上皮-间充质转化有关。EMT通常被认为是转移的第一步，因为它与E-cadherin表达减少和N-cadherin出现有关[16.］．

另一个因素与淋巴结的参与有关——巨噬细胞的存在——这也被我们的研究证实。我们的结果表明，正如之前报道的那样，淋巴结转移组中巨噬细胞的数量明显更高[17.］．最近已经表明巨噬细胞也参与EMT过程[18.］．它们不仅表达诱导emt的细胞因子，还表达切割E-cadherin/的MMP9连环蛋白复杂。Tan等人认为巨噬细胞MMP9也通过破坏基底膜来支持EMT。这是癌细胞侵入其他组织的关键机制。

我们对MMP2活性的分析表明MMP2对胰腺癌的发展有更大的影响。它的活性甚至可以在肿瘤的早期阶段观察到。相反，MMP9活性仅在G2和G3组中观察到。MMP2以前被报道可以增加癌细胞的迁移能力[19.]，并被告知测定胰液中MMP2活性对诊断胰腺癌很有用[20.］．MMP9与转移和血管生成有关[21.］．在G1组中缺乏其活动可能表明它在肿瘤的后续阶段被触发。

5.结论

在我们的研究中，我们证明了影响肿瘤微环境C-MET受体的许多因素，浸润巨噬细胞و和MMP2对胰腺癌的发育和侵袭具有显着影响。他们所有人都可能有助于EMT，我们打算在进一步的研究中审查这一点。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

该想感谢Anna Nasierowska-Guttmejer教授和Dorotałęcka博士的肿瘤组织病理学评估。本研究是以科学和高等教育部的支持进行了支持，授予NO。NN404 / 0693/33。

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