分析喀斯特快照分析外显子2密码子12和13的突变与普通DNA测序的比较

摘要

因为要求快一点喀斯特单克隆抗体治疗转移性结直肠癌患者的突变状态分析，需要敏感、经济、容易可行的方法。在这方面，对比常用的DNA测序，检测SNaPshot分析的敏感性和特异性。我们检查了喀斯特对100例胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌原发灶或转移灶的固定石蜡包埋肿瘤组织样本进行DNA测序和SNaPshot分析，发现外显子2密码子12和13的突变。这些样本中有40%显示出突变喀斯特基因测序和快照分析;另外5个样本(45/100)仅通过SNaPshot鉴定。喀斯特采用可靠的SNaPshot分析方法进行突变检测是可行的。快照分析对较频繁的突变检测表明，该方法在检测中具有较高的准确率喀斯特突变与测序相比。

1.介绍

大肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胰腺癌是世界上最常见的三种癌症死亡原因。

现有的治疗是针对表皮生长因子受体(EGFR)的，如Panitumumab [1- - - - - -4]和西妥昔单抗[5- - - - - -8(两种单克隆抗体)治疗转移性大肠癌，吉非替尼治疗非小细胞肺癌，厄洛替尼治疗非小细胞肺癌和胰腺癌。西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结直肠癌的成功取决于非突变喀斯特基因;治疗无效如果喀斯特基因有任何突变[1，5，6，8，即使在没有配体(如表皮生长因子)的情况下，g蛋白也会被激活[9，10］．尽管进行了治疗，这仍导致细胞进一步恶性增殖。

两个密码子喀斯特基因主要是已知的产生交替蛋白，构成性激活，没有配体结合到EGFR的信号。这是密码子12和13在外显子2喀斯特基因(9，10］．这两个密码子编码野生型蛋白质中的甘氨酸。替换前两个碱基中的一个会导致两个密码子在KRAS蛋白中的氨基酸交换，从而导致肿瘤对上述治疗的耐药性。

甘氨酸的替换导致gap的抗性，这是导致KRAS结合的GTP水解到GDP的蛋白质。在突变的KRAS中，gap无法影响GTP水解，导致构成活性蛋白[10］．

到目前为止喀斯特突变分析主要通过DNA测序进行[5]和商业化的DNA-DNA杂交测试系统(例如，德国柏林Chipron)、焦磷酸测序[11，或Therascreen: K-RAS突变试剂盒来自Qiagen [12基于实时荧光定量PCR技术。考虑到非同质基因型喀斯特肿瘤细胞的突变状态，需要更灵敏的检测方法。如果肿瘤有少量的喀斯特突变的细胞，不能被DNA测序检测到，抗egfr治疗可能对这些细胞没有抗增殖作用。

SNaPshot分析被认为比普通DNA测序更可靠[8并能够检测微小的突变等位基因数量喀斯特．本研究的目的是将SNaPshot方法与DNA测序进行比较，以进行筛选喀斯特突变。

2.材料和方法

２.１.肿瘤组织样本和DNA提取

我们的研究使用了不同来源的肿瘤组织样本:NSCLC的正常诊断病例(， 33例手术切除标本，8例活检标本);， 18例手术切除标本和2例活检标本)，归档胰腺癌(， 8例手术切除标本和11例活检标本)，并对FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)材料的结直肠癌标本载玻片进行实验室间比较喀斯特2008年春季，由德国病理学会组织的突变筛选。所有的标本都是匿名的，由病理学家检查，他们选择一个至少有70%重要肿瘤细胞的肿瘤区域进行dna分离。Weichert等人[13]提到，无论采用何种方法，肿瘤细胞含量小于10%的标本的突变率都较低。

将肿瘤组织固定在载片上(3μm厚)，脱去石蜡，使用QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany)对组织材料进行显微解剖提取DNA。实验室间比较切片上的组织材料经显微镜鉴定为肿瘤组织和正常组织，并从两份组织样本中提取DNA ()．

２.２.快照和测序分析前的扩增步骤

从样本中提取基因组DNA后喀斯特基因外显子2通过PCR(使用HotStarTaq DNA聚合酶，Qiagen, Hilden, Germany)扩增，引物如下:5 ' -AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3 '和5 ' -CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3 ' [8］．在琼脂糖凝胶上检测扩增产物后，用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)对PCR反应进行纯化，用于测序和SNaPshot反应。

每个PCR反应有25μL体积及包含量:上述引物以400 nM, 1 × PCR缓冲液，2.5 mM MgCl设置₂, 0.1μ克/μlbsa, 5个聚合酶单位，200μ每个脱氧核苷酸的M，基因组DNA的100 ng。PCR反应了以下计划:95°C初始激活HotStarTaq DNA聚合酶的变性15分钟,第二步在94°C变性30秒,第三步退火的引物模板在55°C 30秒,第四步30秒72°C的底漆扩展。步骤2 ~ 4重复45次，72℃延伸10分钟，将PCR反应冷却至8℃。一种PCR制剂用于测序反应和SNaPshot分析。

２.３.DNA测序

将纯化的DNA作为模板，使用BigDye Terminatorv1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Forster City, CA)进行测序反应。测序反应用3 '喀斯特引物(5“-CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3”)与下面的程序thermocycler: 1分钟首次变性的DNA在96°C,紧随其后的是25秒周期变性在96°C,引物的退火50°C 5秒,60°C和扩展步骤4分钟。程序完成后，样品保存在4°C。

在3130基因分析仪上进行毛细管电泳，得到的电泳图(图1 (b))用finchTV (Geospiza, Seattle, WA, USA)软件(在线应收)进行分析。

２.４.快照

SNaPshot使用的引物按照Di Fiore等人的算法实现[8]:密码子12位置1;5 ' -AACTTGTGGTAGTTGGAGCT-3 '，密码子12 2位;5 ' -GATCGTACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 '，密码子13第1位;5 ' -GATCGATCGATCTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-3 '，密码子13 2位;5“-GATCGATCGATCGATCGATGTGGTAGTTGGAGCTGGTG-3”。这些引物在模板DNA上的潜在突变碱基之前退火一个核苷酸位置，在SNaPshot Multiplex Kit(应用生物系统，福斯特市，CA，美国)聚合过程中，只有这个核苷酸作为双脱氧核苷酸添加到引物序列。由于核苷酸脱氧核糖上缺少3 ' -羟基，因此不能进行进一步的聚合。

SNaPshot反应发生在10分μL体积为1μL PCR产物μL快照多路复用主混合，和一个2μM的浓度。在热循环器上的程序是25个循环，96°C变性10秒，50°C预退火5秒，60°C延伸30秒，然后冷却到4°C。SNaPshot反应完成后，需要进行纯化步骤以消除无干扰的核苷酸。加1μL虾碱性磷酸酶(1u /μL) (NEB, Ipswich, MA)，在37°C孵育1小时，然后在75°C变性15分钟，在3130遗传分析仪(应用生物系统，福斯特市，CA)上清理SNaPshot反应用于毛细管电泳。

毛细管电泳使用内部DNA大小阶梯，GeneScan-LIZ 120大小标准(应用生物系统，福斯特市，CA)。不需要进一步的分析程序;有关数据可直接从电泳图读取[8(例如,图1(一))．

2．5．统计分析

SNaPshot分析的灵敏度和特异性喀斯特突变筛选与普通DNA测序进行了比较。假设DNA测序为标准方法，特异性和敏感性为100%。

3.结果

在100个被分析的组织样本中，45个(45%)的样本中，a喀斯特检测到密码子12或13发生突变。40例(88.9%)发生突变喀斯特另外5个突变(11.1%)仅能被SNaPshot检测到。这导致灵敏度为100%，置信区间为95%[91.2% - 100%]，特异性为91.7%，置信区间为95%[81.6% - 97.2%]。

数字1显示了一个由SNaPshot而不是由测序检测的突变的例子。分析的肿瘤标本分别为非小细胞肺癌、大肠癌和胰腺癌。对于非小细胞肺癌，我们检测到15/41 (36.6%)喀斯特-突变癌组织样本，6/20 (30%)喀斯特14/19(73.7%)胰腺肿瘤样本和9/20(45%)结肠直肠癌样本实验室间比较的突变。

突变的类型喀斯特外显子2密码子12和13可以按转换和转位分组。过渡的突变喀斯特外显子2密码子12和13在胰腺癌中占绝大多数(71.4%)。非小细胞肺癌喀斯特突变主要表现为转化(78.6%)和喀斯特结直肠癌的突变以转移和转位的形式分布均匀。在NSCLC样本中，出现G37T、G38A、G35T、G34T和G35A。结直肠标本显示G34A、G38C、G35A、G34T突变。胰腺癌有三种不同的类型喀斯特突变:G35A、G34C和G35T。的那种喀斯特在组织样本中发现的突变在图中明确列出2与总突变数的百分比。

4.讨论

给定的百分比喀斯特NSCLC的突变率为21-43% [4，14]及33% [15]结肠直肠癌和胰腺癌的发病率为75-82.4% [15，16］．喀斯特在我们的检查中，突变频率显示非小细胞肺癌为36.6%，大肠癌为30%。73.7%的突变喀斯特胰腺癌的基因与之前描述的数据一致[15］．

关于现在的先决条件喀斯特帕尼单抗和西妥昔单抗治疗前的突变筛查，喀斯特是一种强大的癌症诊断分子标记[1，5］．分子癌症诊断正在为这些患者提供更个性化的治疗。这一目的使肿瘤的分子筛选成为必要，这揭示了与化疗反应相关的癌症特征。

一些研究表明，西妥昔单抗治疗EGFR表达的转移性结直肠癌患者获益更大喀斯特野生型(5- - - - - -7］．西妥昔单抗一线治疗联合奥沙利铂、亚叶酸钙和氟尿嘧啶提高转移性结直肠癌患者的总体缓解率[17］．

在转移性结肠直肠癌药物反应的重要预测之外，喀斯特关于厄洛替尼或吉非替尼，突变也可能对NSCLC的药物决定起决定性作用，因为这些激酶抑制剂似乎在与Erlotinib或Gefitinib的癌症中无效喀斯特突变(12，16，17］．Eberhard等人[14在突变的情况下，厄洛替尼和顺铂治疗的患者中位进展时间和生存时间较短喀斯特与单独接受顺铂治疗的患者相比。喀斯特似乎不是一个预测因素[15在一项使用吉非替尼和化疗治疗晚期结直肠癌的研究中。

特别是在不断扩大的领域喀斯特突变状态检测，需要以可靠的方式确定等位基因的状态。因此，知识之道喀斯特在决定使用egfr靶向Panitumumab和西妥昔单抗治疗癌症患者之前，基因突变状态是至关重要的。考虑到治疗的巨大成本和副作用喀斯特基因突变分析是必要的。

喀斯特突变可通过以下几种方式进行筛选:DNA测序、DNA-DNA杂交商业化测试系统和快照分析[8］．在本文中，我们将常用的测序分析与SNaPshot进行了比较，认为SNaPshot更可靠[8］．统计分析表明，我们的结果确实揭示了一个更好的突变检测。灵敏度为100%，特异度为91.7%，提示该SNaPshot具有较高的准确性。

为确保突变结果呈阳性，避免假阳性，还建议在无核酸对照样本(“水对照”)旁边运行a喀斯特使用已知的Wildtype控件喀斯特序列。

除了增强的可靠性之外，SNaPshot分析还显示了一些优点。它比测序分析更便宜，速度更快(SNaPshot 11€和19€用于DNA测序)，除了Genemapper程序(Applied Biosystems, Forster City, CA, USA)，无需其他软件即可进行分析。考虑到这些特性，SNaPshot分析可以取代DNA测序喀斯特突变筛查。

Therascreen: K-RAS突变试剂盒来自Qiagen [12]使用arms技术和scorpion引物的组合，因此可以确定只有1%的突变基因在野生型基因型背景下的突变。但该试剂盒只能检测到7种可能的突变类型喀斯特但密码子12和13中有12个突变。在我们的分析中，我们检测到2种突变类型，其中一种在大肠癌标本中，用therascreen试剂盒检测为假阴性。

的喀斯特突变可以在转换和转变中再细分。这两种反应都导致氨基酸甘氨酸与蛋白质中的另一种氨基酸交换。转变是一个嘌呤碱基替换到另一个嘌呤碱基或者一个嘧啶碱基替换到另一个嘧啶碱基，而翻转是嘌呤碱基替换到嘧啶碱基或者相反。在这三种不同的肿瘤组织中，转移和转位的发生分布并不均匀。转位在非小细胞肺癌中更常见，在胰腺癌中更常见。两种突变类型在大肠癌中发生均匀。突变类型的发生频率不等表明这三种肿瘤的情况不同。对于一个跃迁，只需要加减氨基就可以了。对于转换，必须移除碱基，并添加新的碱基。Riely等显示了喀斯特肺癌基因在从不吸烟者中发生的频率高于以前或现在吸烟的人。这可能意味着，转化突变与吸烟有关[18］．

的协议喀斯特仅通过SNaPshot检测，是否可以缩短PCR的纯化步骤，仅使用SAP/EXO降解干扰核酸。根据PCR产物的大小，只需添加合适的引物和PCR产物，SNaPshot就可以扩展到新识别的SNPs。这是一种比较便宜的方法来分析其他基因组区域的snp，只需要添加PCR和SNaPshot反应的引物。然而，对于未考虑的序列，数据不能重新分析。快照必须用其他引物重复。

微小比例的突变喀斯特利用上述方法可以很容易地筛选到等位基因。在事件的喀斯特西妥昔单抗和帕尼单抗单克隆抗体的治疗应停止[5，11］．微小的等位基因数量突变喀斯特提示大多数野生型细胞涉及喀斯特肿瘤中的基因。缺乏量化喀斯特突变的等位基因可能会剥夺患者的治疗，这可以针对完整的肿瘤细胞喀斯特基因。因此,喀斯特SNaPshot的突变检测可以在治疗的反应预测中发挥更大的作用，这取决于由于突变的数量可以预期哪种反应喀斯特肿瘤中的等位基因。

利益冲突

作者表示没有潜在的利益冲突。

参考文献

1. R. G. Amado, M. Wolf, M. peters等人，“野生型”喀斯特panitumumab在转移性结直肠癌患者中的疗效是必需的，”临床肿瘤学杂志第26卷第2期10, pp. 1626-1634, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. M. peters, J. Balfourf，和D. Arnold，“综述文章:panitumumab -一种治疗转移性结直肠癌的全人类抗egfr单克隆抗体，”消化药理学与治疗学第28卷第2期3，页269-281,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. R. M. Giusti, K. A. Shastri, M. H. Cohen, P. Keegan，和R. Pazdur，“FDA药物批准总结:panitumumab (Vectibix™),“肿瘤学家，第12卷，第2期5，页577-583,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/opinion/40511307en.pdf．
5. A. Lièvre, J. B. Bachet, D. Le Corre等，"喀斯特突变状态可预测结直肠癌对西妥昔单抗治疗的反应。癌症研究第66期8，第3992-3995页，2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. A. Lièvre, J. B. Bachet, V. Boige等，”喀斯特突变作为晚期结直肠癌患者西妥昔单抗治疗的独立预后因素。临床肿瘤学杂志第26卷第2期3，第374-379页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. W. De rock, H. piesseaux, J. De Schutter et al. "喀斯特野生型状态预测生存，并与转移性结直肠癌使用西妥昔单抗治疗的早期放射反应有关。”《肿瘤学第19卷第2期3, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. F. Di Fiore, F. Blanchard, F. Charbonnier et al， "临床相关性喀斯特西妥昔单抗联合化疗治疗转移性结直肠癌的突变检测英国癌症杂志，第96卷，第2期8，页1166-1169,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 人类癌症中的ras致癌基因:综述癌症研究，第49卷，第49期。17，第4682-4689页，1989。视图:谷歌学术搜索
10. S.舒伯特，K.香农，G. Bollag，《发育障碍和癌症中的Ras过动症》，自然评论癌症，第7卷，第5期4，页295-308,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. s.g Ogino, T. Kawasaki, M. Brahmandam et al.，“敏感测序方法喀斯特通过焦磷酸测序进行突变检测，”分子诊断杂志，第7卷，第5期3，页413-421,2005。视图:谷歌学术搜索
12. http://www.dxsdiagnostics.com/Site/PDF/CMP/TheraScreenKRAS/IFU-KRAS-TheraScreen-ZA.pdf．
13. W. Weichert, C. Schewe, A. Lehmann et al.， "喀斯特常规诊断中结直肠癌石蜡包埋组织的基因分型:方法比较和组织学影响分子诊断杂志，第12卷，第2期1，第35-42页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. D. A. Eberhard, B. E. Johnson, L. C. Amler等，“表皮生长因子受体的突变和在喀斯特是单独化疗和厄洛替尼联合治疗的非小细胞肺癌患者的预测和预后指标。”临床肿瘤学杂志，第23卷，第2期。25，页5900 - 5909,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. S. Ogino, J. A. Meyehardt, M. Cantor等，“肿瘤分子改变和吉非替尼联合化疗治疗晚期结直肠癌的反应”，临床癌症研究，第11卷，第5期。18，页6650-6656,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. J. Ugorčáková， T. Hlavatý， P. Babál等，“基于突变体富集PCR的胰腺癌K-ras基因突变检测方法的设计和优化”，赘生物，第53卷，第53期5，页363-371,2006。视图:谷歌学术搜索
17. C. Bokemeyer, I. Bondarenko, A. Makhson等，“氟尿嘧啶、亚叶酸钙和奥沙利铂联合和不联合西妥昔单抗在转移性结直肠癌一线治疗中的作用”，临床肿瘤学杂志第27卷第2期5，第663-671页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. G. J. Riely, M. G. Kris, D. Rosenbaum等，“频率和独特的光谱喀斯特从不吸烟者肺腺癌的突变临床癌症研究第14卷第2期18，页5731-5734,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2010 Rica Zinsky等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。