瑞舒伐他汀抑制小鼠肝癌血管动脉化和窦状毛细血管化，减少肿瘤生长，延长生存率

抽象的

背景和目标．在人肝细胞癌(HCC)中，肝血管的特点是动脉血供和血窦的表型变化。我们研究了瑞舒伐他汀对肝癌患者肝血管异常、肿瘤生长和生存的影响。方法．我们治疗的转基因小鼠发育HCC，其特征在于血管异常，其与人HCC的血管异常，具有罗萨伐他汀。结果．在罗苏伐他汀组，生存时间更长，和肝脏重量和结节表面是减少了。瑞舒伐他汀降低平滑肌肌动蛋白阳性动脉数量并通过降低层粘连蛋白表达来预防窦状突异常，激活的肝星状细胞， Notch4活性表达。此外，瑞舒伐他汀抑制内皮细胞但不抑制肿瘤肝细胞功能。结论．罗苏伐他汀降低了血管异常和肿瘤生长，延长了HCC的存活。这些结果代表了他汀类药物对肿瘤血管生成和HCC潜在靶疗法的新机制。

1.介绍

肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的癌症，预后差。血管异常是大且中度或差异差异化的主要特征[1，2］．潜在的治疗方法仅适用于高度选择的患者。Sorafenib是血管生成和肿瘤生长的口服多立糖酶抑制剂靶向受体，是唯一为高级HCC中生存时间而且显着提高的系统性治疗唯一的全身治疗方法[3.］．

在患有耐药性的各种机制中，线粒体胆固醇可以在HCC中介导对化疗的抗性[4］．因此，抑制3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶的他汀类药物，导致甲戊酸和胆固醇合成的降低[5，在HCC中与传统疗法结合使用可能会很有趣。然而，在心血管治疗中使用他汀类药物的临床试验未能提供关于其抗癌作用的结论性结果[6］．相反，最近的一项研究表明，他汀类药物治疗可显著降低糖尿病患者的HCC风险[7］．因此，他汀类药物可能对HCC有益效果，可能与其对肝细胞的自然靶向相关[8］．普伐他汀治疗，单独或联合化疗栓塞，提高晚期肝癌患者的生存率[9，10.］．

他汀类药物对血管生成的影响是不同的，这取决于药物浓度和使用的实验条件[11.- - - - - -14.］．他汀类药物减少了涉及细胞存活，增殖和迁移的小GTP酶蛋白的法金黑化和天竺葵化[15.］．Ras和Rho是gtp结合的小蛋白，是他汀类药物的主要靶标[16.］．通过防止RhoA定位对细胞膜，Cerivastatin降低内皮细胞（ECS）迁移，并减少基质胶中的血管生成和血管基质膜测定[17.］．

Folkman 40年前描述的概念，描述肿瘤生长需要肿瘤新生血管形成(血管生成开关)，似乎比想象的更为复杂[18.］．一些肿瘤如HCC不源于养血组织[19.，20.］．严重的肝血管异常是人类肝癌的特征[1，2］．与存在于正常肝脏中存在的主要门静脉血液供应和未束的正弦曲线相反，在HCC中观察到动脉化，其特征在于强大的动脉血液供应，具有扩大的动脉和未配对的动脉，与胆管无关。此外，在肿瘤结节中，正弦曲线是无政府状的，融合，曲折和扩张。这些正弦曲面捕获富含层蛋白的基础膜，它们被激活的肝星状细胞（HSCs）包围，具有正弦毛细血管。活化的HSCs表达平滑肌肌动蛋白（SMA）并产生致癌因子[1，21.虽然正常的正弦曲线被HSCS包围，只有HSCs表达Desmin [1，2］．

本研究的目的是确定他汀类药物是否可以通过预防肝血管异常来延缓肝癌的进展和延长生存期。为此，我们使用了在多步血管生成和肿瘤进展中发生HCC的转基因小鼠[22.］．在这个HCC模型中，我们之前将类似的血管异常描述为人类HCC的血管异常[23.，24.]并表明PLGF阻断延迟肿瘤生长并减少动脉化和正弦毛细血管[25.］．

VEGF、Notch和ephrin家族在胚胎发育和成年小鼠血管网络的发展和血管的动脉/静脉分化中发挥关键作用[26.，27.］．在HCC模型中，Notch4受体活性形式Delta-like 4配体和内皮细胞(ECs)表达的ephrin B2在HCC进展过程中逐渐上调，促进肝血管异常[23.］．

在这里，我们证明了与未处理的HCC小鼠相比，牛伐他汀处理的HCC中的肿瘤生长减少了更长的存活率。罗苏伐他汀降低了肝脏脉管系统的动脉化过程，导致较小的动脉和预防窦料毛细血管化，降低了层蛋白和活性Notch4表达。此外，在罗苏伐他汀治疗下减少了围绕正弦素的活化庚酸盐星状细胞的数量。

2.材料和方法

２.１.试剂

以下抗体用于Western印迹和免疫荧光染色实验：一个、兔抗平滑肌肌动蛋白(SMA)和兔抗hif -1α.(Abcam,剑桥,英国);大鼠抗鼠CD31， (Pharmingen Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法国);rabbit anti-Notch4，识别int3/Notch4的截断胞内结构域(Upstate, Euromedex, Mundolsheim, France and Abcam, Cambridge, UK);山羊反β-Actin（C11）（Santa Cruz Biotechnology，CA）和兔抗碱（L-9393）（Sigma，Saint Louis Mi，USA）;和兔子抗疟药（RB-9014）（Neomarker Inc.Fremont CA; USA）。B，蛋白质印迹的二抗：驴抗山羊IgG-过氧化物酶和驴抗津贴IgG-过氧化物酶（杰克逊免疫研究实验室，West Grove，Pa，美国）;C，用于免疫染色的二次抗体：Alexa Fluor 488和555山羊抗津贴和Alexa Fluor 488和555驴抗鼠（Interchim，Asnières，法国）。

2.2。转基因小鼠模型

在别处描述了在MultiSep血管生成和肿瘤进展中的MultiSep血管生成和肿瘤进展中的转基因C57BL6 / ASV-B雄性小鼠已经描述过[22.］．简而言之，使用700个碱基对抗凝血酶调节序列实现转基因小鼠肝脏中SV40 T早期区域表达的精确靶向，以控制癌基因表达。肝癌的发展仅限于用C57BL / 6J小鼠进行回复的雄性小鼠。对小鼠进行治疗，或不（6只小鼠/组），用罗苏伐他汀口服，每日（25mg / kg），来自第四周直到死亡，用于生存研究。通过其亲水性测定罗苏伐他汀的选择，通过细胞色素P450系统具有最小肝代谢[8］．为了进行苏木精伊红(HE)染色、免疫荧光染色和Western blot研究，在弥漫性阶段(16周)处死4只补充小鼠/组，获取肝脏标本。根据法国政府政策，动物手术是在麻醉下进行的(服务Vétérinaires de la Santé et de la Production Animale, Ministère de l’agriculture)。

２.３.肝癌肝细胞的分离和培养

肝细胞从未治疗的HCC肝脏中分离。这一程序是根据Riccalton-Banks [28.］．HCC小鼠（16周）用木质素20麻醉了 μ.克胺/克体重(拜耳，santé animale，普托，法国)加氯胺酮50μ.g/g体重(Virbac, Carros，法国)进行剖腹手术并暴露门静脉。肝通过连接蠕动泵的导管(22G, Vygon, Ecouen，法国)通过门静脉灌注。肝静脉裂开。灌注缓冲液(0.2 M NaCl, 2.7 mM KCl, 0.7 mM Na) 250ml，流速10ml /min₂HPO₄在37℃下，10 mm Hepes pH 7.65），然后加入100ml灌注缓冲液，补充有6.5mM CaCl₂和20 μ.g/ml Liberase (Roche Diagnostics GmbH, Penberg, Germany)， 37°C，流速5 ml/min。灌注后，小心切除肝脏，用20ml灌注缓冲液冲洗2次。剥去肝包膜，用100 ml M199-10% FCS于37℃分离肝脏，使细胞分离。粗制的细胞悬浮液经过60-p的过滤。米米esh nylon screen (SCRYNEL NY60HC, VWR, Fontenay-sous-Bois, France) and sedimented for 30 minutes, at room temperature. The pellet, containing the hepatocyte fraction, was suspended in 100 ml M199-10% FCS and was washed four times (1000 rpm for 5 minutes). Hepatocytes (150 000 cells/cm²)在胶原蛋白涂层板(0.15 mg/ml) (BD, Bedford, MA, USA)中培养，dmem10 % FCS加4.5 g/l葡萄糖。经显微形态学观察，细胞分化良好，呈肝细胞样形态。肿瘤肝细胞扩增，在10% DMSO中冷冻，并保存在液氮中。解冻后的细胞进一步传代，用于实验。

从脐静脉分离人内皮细胞(HUVECs)，并在EBM2-20% FCS + 2ng /ml FGF-2中培养，如所述[23.］．

2.4。细胞增殖和基质胶质测定

对于细胞增殖测定，在DMEM-4.5g / L葡萄糖-10％FCS中，HUVECS（15000个细胞/孔），EBM2-20％FCS和肿瘤肝细胞（50 000个细胞/孔），在6-井文化板。72小时后，用10时用或没有罗苏伐他汀培养细胞 μ.25米,μ.m，和100 μ.m for huvecs和100 μ.m用于肝细胞。每24小时计数细胞（Zeiss Axiovert 25，Carl Zeiss，Sartrouville，法国）。结果是三种实验的平均值±SD在Quintulatication中完成。

在基质凝胶试验中，HUVECs(10万个细胞/孔)在基质凝胶(BD Biosciences, Le Pont-de Claix，法国)12孔培养板上，在EBM2-20% FCS中，在瑞苏伐他汀(100μ.m）。18小时后观察到毛细管状结构形成（Zeiss，Axio Observer Z.1）。使用数码相机（Baumer TXD14，Radeberg，德国）获得图像。三份实验一式两份进行。用HistoLab软件（微辐射，法国）量化萌芽的数量。结果是一式两份进行的三个实验的平均值±SD。

2．5．入侵检测

在无血清培养基中肿瘤肝细胞（75000个细胞/室）在涂覆有Matrigel（BD Biosciences）的插入物中，在罗萨伐他汀（100 μ.M)。下腔充满750颗μ.l RPMI 1640含10% FCS诱导趋化。24小时后，轻轻刮去上腔未迁移的细胞，用甲醇固定插入物下表面贴壁的细胞，用1%甲磺啶/1%硼砂溶液染色，并用Mercator软件(Explora Nova, La Rochelle, France)计数。结果(入侵细胞数)为3次重复实验的平均值±SEM。

2.6。rho激活测定

肿瘤肝细胞或Huvecs在或没有罗萨伐他汀（100 μ.然后，根据制造商的说明(美国丹佛Cytoskeleton公司)，用G-Lisa试剂盒裂解细胞并激活RhoA。简单地说，在生物样品中，活性的，gtp结合的RhoA，而不是非活性的，gdp结合的RhoA，结合到玫瑰金涂层板上。结合的活性RhoA通过特异性抗rho一抗孵育检测，然后是与过氧化物酶结合的二抗。结果以吸光度(490 nm)表示，为三次重复实验的平均值±SD。

2.7。蛋白质提取和Western印迹

如前所述进行肝脏活组织检查（100-200mg）的蛋白质提取[23.］．使用BCA蛋白试剂试剂盒(Pierce, Rockford, Ill, USA)评估蛋白浓度。样品在4X Laemmli缓冲液中煮沸。蛋白样品在MOPS缓冲液(NuPage, Invitrogen, Cergy Pontoise，法国)还原条件下通过4% - 12%梯度SDS-PAGE预制凝胶(NuPage, Invitrogen, Cergy Pontoise，法国)进行电泳。转移后，(iBlot转移装置，Invitrogen公司)，用抗Notch4(1/200)、HIF-1的一抗在4°C孵育过夜α.（1/1000），和β-actin(1/400)，作为内载对照，然后与合适的二抗(1/50 000)孵育。在ECL系统(Pierce, Rockford, Il USA)中发现抗体结合。结果(平均值±扫描电镜)归一化为β-肌动蛋白水平，并以百分比表示。

2.8。免疫荧光（IF）染色

如前所述制备肝切片[22.］．一抗被省略，或与过量的阻断肽一起孵育作为阴性对照。肝切片用一抗:单克隆大鼠抗cd31(1/50)、抗层粘连蛋白(1/100)、抗结丝蛋白(1/200)、抗notch4(1/100)、抗sma(1/50)，然后用合适的二抗(1/200)孵育。所有免疫染色采用标准荧光显微镜(Zeiss Axio Observer Z1, Microvision, Evry，法国)进行分析。

采用Histolab软件(Microvision)，由盲法研究者进行区域染色和血管定量。结节大小通过测量每个光场的面积(每个肝脏3个光场)来确定。CD31、层粘连蛋白、结粘连蛋白和SMA的正弦表达通过测量每个光场的面积(每个肝脏3-4个光场)来测定，通过每个切片的血管计数来获得SMA血管密度。

2.9。统计分析

对生存时间进行Logrank测试。数据在统计上使用学生进行统计分析t以及(Excel;微软),被认为是重要的（；；)．

3.结果

3.1。罗苏瓦司汀延长生存率并延缓HCC小鼠的肿瘤生长

瑞舒伐他汀治疗的肝细胞癌小鼠比未治疗的肝细胞癌小鼠的生存时间显著延长。瑞舒伐他汀治疗的肝细胞癌小鼠中位生存期为216天(范围:214-220)，未治疗组为195天(范围:193-198)。)(图1(一))．

第16周时，未治疗的HCC小鼠肝脏重量显著增加(g)与正常野生型小鼠(N)比较(g) ()(图1 (b))．瑞舒伐他汀治疗显著降低肝脏重量( g,)(图1 (b)）和肝脏大小（图1 (c))．瑞舒伐他汀治疗后肝细胞癌肝脏出现小结节(图)1 (c))．

然后通过HE染色分析肝脏结构。在未治疗的HCC弥漫性阶段(16周)，肝组织内存在大且融合的肿瘤结节(图)1 (d))．相比之下，在16周时，瑞舒伐他汀治疗后肝组织内出现更小的结节(图)1 (d)）．瑞舒伐他汀治疗的肝癌患者的平均结节表面积显著减少( mm²）与未经处理的HCC肝脏相比（ mm²；)(图1 (e))．总的来说，这些结果表明Rosuvastatin延迟了HCC进展。

3.2。Rosuvastatin可以防止HCC肝脏中的正弦异常

我们分析了正常肝脏中的正弦曲线，并在未处理和罗斯汀治疗的HCC肝脏中的结节和细胞区分析（图2(一个))．如前所述[22.，在正常肝脏中观察到一个薄的、规则的窦状网，而在未治疗的HCC肝脏中观察到融合、扩大和弯曲的窦状网。结节内的正弦异常比结节间区更明显(图)2(一个))．与未治疗的HCC相比，治疗后的HCC结节和结节间区窦房结的扩大和混乱程度较低(图)2(一个))．

然后我们进行CD31染色(图2 (b))．正常肝脏常规正弦网络中的SinUnoidal ECS中CD31的一种非常微弱的表达（图2 (b))．相比之下，在未治疗的肝细胞癌中，在扩大、曲折、异常的肝窦内壁的内皮细胞中观察到CD31的强表达(图)2 (b))．有趣的是，在瑞舒伐他汀治疗下，窦状上皮细胞的扩张更少，更规则，CD31表达更弱(图)2 (b))．

罗苏伐他汀显着降低了正弦表面区域。CD31正面区域是μ.米²在未经处理的HCC肝脏上μ.米²瑞舒伐他汀治疗的HCC ()(图2 (c))．

3.3。罗苏瓦司汀可防止HCC肝脏中的正弦毛细血管

在正常的肝脏中，正弦骨是未束的血管，没有平静覆盖，但是由表达脱氨林的正常肝星状细胞（HSC）包围。在HCC中，正弦曲面发展成毛细血管。他们获得富含层蛋白的基础膜，并被表达SMA的活化HSC包围[1，2，25.］．

层粘连蛋白在正常肝脏中未表达，而在未治疗的HCC肝脏中显著表达(图)3(一个))．在瑞舒伐他汀治疗的肝脏中，观察到较弱的层粘连蛋白染色(图)3(一个))．此外，在罗苏伐他汀治疗下，正弦曲面的形状和尺寸更规则，确认他和CD31染色（图3(一个))．然后，我们比较了未治疗和治疗的肝细胞癌肝脏中层蛋白阳性窦状突的平均表面。瑞舒伐他汀降低层粘连蛋白表达(层粘连蛋白阳性区域:μ.米²治疗与域μ.米²/未经处理的HCC肝脏的字段（)(图3 (d))．

然后，我们进行了CD31 / Desmin和CD31 / SMA双免疫抑制，以分析HSCs表型。

在正常的肝脏中，斯米林染色血管细胞源于门静脉和非活化的HSCs（图3 (b)，请参见在DOI在线提供的补充材料中的图1（a）：10.1155 / 2010/640797。），而SMA仅染色（图3 (c)，补充图1（b））。罗苏伐他汀治疗的亡灵阳性区域（μ.米²/场)比未治疗的肝细胞癌患者(μ.米²/字段,)(图3（e）)．在正常肝脏中，在动脉中衍生自门移尸体和SMA染色的平滑肌细胞的血管中的椎间氨酸染色的壁细胞（补充图1（a），1（b）。CD31阳性正弦ECs被非活化的HSC包围在正常，未处理和罗斯伐他汀处理的HCC肝脏中表达脱霉素（（补充图1（a）），同时仅通过仅在HCC肝脏中表达SMA的活化HSC（补充图1（b））。有趣的是，在罗萨伐他汀治疗的HCC中肝脏，CD31阳性正弦ECS比未处理的HCC肝脏（补充图1（a））更强烈地围绕着非活化的去氨姻阳性HSC。

在正常肝脏，SMA染色动脉平滑肌细胞(图3 (c))．瑞舒伐他汀显著降低sma阳性激活的造血干细胞与未治疗的HCC相比(图)3 (c)和3（f）)．SMA阳性HSCs的平均表面积是μ.米²治疗与域μ.米²/未经处理的HCC肝脏的字段（)(图3（f）)．在处理过的HCC肝脏中，CD31阳性正弦ECS不受未处理的HCC肝脏中的SMA阳性活化的HSC围绕着围绕着（补充图1（b））。总之，这些数据表明Rosuvastatin损害了HSC活化并防止了HCC中的正弦毛细血管。

3．4．瑞舒伐他汀可预防肝癌肝动脉化

在健康的肝脏中，门静脉供应大部分的肝血流。相比之下，HCC的特点是肝动脉血供增加，导致动脉数量增加[1，2，25.］．

我们观察到，与未接受治疗的HCC肝脏相比，瑞舒伐他汀降低了HCC中sma阳性动脉的数量(/毫米²/节治疗的HCC与/毫米²/未经治疗的HCC，） （图4(一)和4（b）)．

3．5．瑞舒伐他汀降低肝细胞癌窦状内皮细胞活性Notch4的表达

我们之前报道过肿瘤正弦肠ECs改变其表型并表达活性形式的Notch4，动脉EC标记[23.］．如前所述，Notch4由HCC肝脏中的正弦ECS表达（图5（a）)．与未处理的HCC肝脏相比，较少的正弦曲线表达了Notch4治疗（图5（b）)．通过Western Blot，我们证明罗苏伐他汀显着降低了活性Notch4的水平71％（)(图5 (c))．

3.6。Rosuvastatin降低了HIF-1的表达α.在HCC肝脏中

我们之前描述过HIF-1α.HCC肝脏中的使者增加了[22.］．在这里，我们通过western blot显示，HIF-1α.水平增加到%的肝细胞癌与正常肝比较(图6)．与未经处理的HCC相比，罗苏伐他汀显着降低了HIF-1α.水平％（)(图6)．

3.7。瑞舒伐他汀对肿瘤肝细胞增殖、侵袭和Rho活性无影响

我们首先分析了HCC进展的延迟与Rosuvastatin对肿瘤肝细胞的影响有关。ki67阳性细胞/领域的数量在治疗之间没有显着差异（）未经治疗的HCC肝脏（)，且明显高于正常肝脏(，） （图7(一)和7 (b))．

伐(100μ.M)对肿瘤肝细胞增殖和侵袭无影响(图7 (c)和7（d）)．

由于rho是他汀类药物的靶标，我们研究了罗苏伐他汀处理下培养的肿瘤肝细胞的体外活化。伐(100μ.M)没有改变肿瘤肝细胞中Rho的激活(图7（e）)．

因此，我们的结果表明瑞舒伐他汀并不直接作用于肿瘤肝细胞。

3.8。罗苏伐他汀抑制Huvecs的增殖，分化和Rho活化

然后我们分析了瑞舒伐他汀对HUVECs的体外作用。瑞舒伐他汀对HUVEC增殖的抑制作用(10-100μ.m）剂量和时间依赖（图8（a）)．24小时后，瑞舒伐他汀对所有浓度的HUVEC的抑制作用约为25%。在48和72小时后观察瑞舒伐他汀的剂量依赖效应。48小时后，瑞舒伐他汀显著抑制HUVEC增殖49% (), 64% ()， 78% (）10,25和100 μ.M,分别。72小时后，抑制率达到66% (），76％（)及95% (）10,25和100 μ.分别为M(图8（a）)．

在没有罗苏伐他汀的情况下，Huvecs在Matrigel中的高度分支发芽网络分化为毛细管样结构（图8（b）)．在瑞舒伐他汀存在的情况下，HUVECS形成芽，芽的数量在未处理和瑞舒伐他汀处理的HUVECS之间没有显著差异(图)8（c）)．在Rosuvastatin治疗下，Huvecs在没有内腔而不是毛细管样结构的情况下分化为帘线（图8（b）)．

同样的结果在人微血管内皮细胞基质干细胞中也得到了(数据未显示)。

然后分析瑞舒伐他汀对HUVECS中Rho活化的影响。瑞舒伐他汀抑制Rho激活81% (）在25岁时 μ.m和86％（)在100μ.m（图8（d）)．

4。讨论

人HCC中的高血管性的特征在于肝脏脉管系统的严重异常，随着动脉血管增加，定义为动脉化，以及正弦曲线的表型修饰，定义为毛细血管[1，2］．在MultiSep血管生成和肿瘤进展中发育HCC的转基因小鼠[22.]我们向人类HCC中报告了类似血管异常[23.- - - - - -25.］．因此，该模型适用于分析瑞舒伐他汀对肝血管异常和肿瘤进展的影响。因为索拉非尼是唯一被批准用于晚期HCC的治疗方法[3.[我们决定分析该转基因HCC模型中HCC弥漫性阶段（16周）对罗斯杜拉汀的影响。

在此研究中，我们发现瑞舒伐他汀在体内显著降低了肿瘤的生长(按肝脏重量和结节大小评分)，并显著延长了发生HCC的转基因小鼠的生存期。HCC进展、化疗耐药性和肝内复发已被报道由Rho GTPase信号调节，这是他汀类药物的主要靶点[29.，30.］．在其他啮齿动物的HCC模型中，他汀类药物降低肿瘤进展，肺转移和微血管密度。然而，他汀类药物对存活的影响是未建立的[31.，32］．他汀类药物在HCC中的有益作用可能与其天然靶向肝细胞有关[8］．有趣的是，在未治疗和瑞舒伐他汀治疗的HCC肝脏中，增殖肝细胞的数量没有差异。此外，瑞舒伐他汀没有抑制，在体外，从HCC肝脏中分离的肿瘤肝细胞的增殖和侵袭和这些肝细胞中的rhO活化。

因此，我们专注于罗苏伐他汀对HCC肝脉管系统的体内作用。与主要的门静脉血液供应与正常肝脏中的高蕨类鼻窦形成鲜明对比，强烈的动脉血管血管血管血管血管血管血管血管血管和正弦血管的毛细管化表征HCC血管网络[1，2］．我们之前已经通过超声测量和微动脉造影研究表明，在我们的HCC模型中，主要的动脉血液供应与动静脉分流[24.］．此外，我们还在这个模型中表明，肿瘤窦状细胞表达层粘连蛋白，肿瘤窦状细胞获得动脉表型[22.，23.］．人类HCC和我们的模型中肝血管网络的相似性促使我们研究瑞舒伐他汀是否可以消除HCC中的肝血管异常．

在这里，我们已经表明，罗苏伐他汀显着降低了SMA阳性动脉的数量，这表明罗苏伐他汀预防我们的HCC模型中的动脉化。

我们还证明瑞舒伐他汀可以抑制窦状突的表型改变。事实上，瑞舒伐他汀治疗的肝细胞癌中，窦道没有那么混乱、曲折和扩张，并且部分失去了富含层粘连蛋白的基底膜。正常窦状细胞缺乏周细胞，被desmin阳性的造血干细胞包围，而激活的sma阳性造血干细胞在HCC中存在[1］．我们的HCC模型中存在类似的异常。实际上，与正常肝脏相比，在HCC中增加了去氨酰阳性HSC，而活化的SMA阳性HSC在HCC中增加。有趣的是，罗苏伐他汀增加了非激活的去氨酰阳性HSC的数量，并降低了HCC中活化的SMA阳性HSC的数量。

Notch信号调节细胞增殖和分化，Notch表达的解除调节在HCC中有描述[33］．Notch1的过度表达抑制HCC细胞的生长[34］．相反，下调Notch1信号通路可导致肝癌细胞生长抑制和凋亡[35］．

动静脉内皮细胞命运由VEGF和Notch家族调控[26.，36］．我们之前报道过，VEGF-A/Dll4/活性Notch4/ephrine B2级联可促进HCC中的肝血管异常，并且Notch4仅在肿瘤窦状ECs中表达[23.］．Notch4的组成型激活诱导成年小鼠中的动静脉畸形，特别是在肝脏中[37］．Notch4信号促进小鼠肺和脑动静脉畸形[38，39］．由于Notch4信号传导诱导血管异常，我们分析了罗斯汀治疗中的活性Notch4而不是Notch1的肝脏表达。在这里，我们展示罗苏伐他汀减少了Notch4的活性形式的水平，较少的Notch4阳性正弦曲线。有效的Notch4表达的这种降低部分地有助于Rosuvastatin对HCC模型中肝血管异常的有益作用。

即使高血管性是HCC的标志，肝脏血管异常也会导致HCC肝功能的功能灌注受损，促进缺氧[1，25.］．缺氧诱导血管生成细胞因子的合成，刺激HCC细胞生长和抗疗法[40］．此外，活化的HSCs分泌血管生成因子并损害氧气递送[1，41，42］．赞成这一假设，我们以前表现出HIF-1的增加α.HCC模型中的信使水平[22.］．在这里，我们展现了HIF-1的增加α.与正常肝脏相比，未治疗的肝细胞癌的蛋白水平。有趣的是，我们展示了HIF-1α.在罗苏伐他汀治疗中受损。阻断该循环可以改善功能性肝血管和HCC疗法的效率。

据我们所知，他汀类药物对预防动脉化和正弦毛细血管毛细血管的这些影响尚未报道。

他汀类药物可以在体外促进或抑制EC血管生成[11.- - - - - -14.］．我们发现瑞舒伐他汀抑制HUVECs增殖，扰乱了Matrigel中的毛细血管网络，但未扰乱芽数，并降低了Rho的激活。

综上所述，我们的数据显示瑞舒伐他汀可防止肝窦毛细血管化和肝血管动脉化，这可能导致肝癌患者肿瘤生长减少和生存时间延长。瑞舒伐他汀抑制内皮细胞，但不抑制肿瘤肝细胞功能，这可能表明瑞舒伐他汀靶向内皮细胞而非肿瘤肝细胞。这些结果代表了他汀类药物对肝癌肝血管正常化作用的新机制，并提出了优化晚期肝癌治疗的潜在靶点。

致谢

这项研究部分得到了支持的Ligue Nationale Contre Le癌症的支持。作者承认R. R. Porcher博士为统计分析，为脐带提供的脐带，以及用于动物护理的Yves Millet。A.Tijeras-Raballand，P. Hainaud-Hakim和J.-o。对象同样为这项工作进行了贡献。

补充材料

参考

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