斑马鱼模型对盆地 - CM02的抗炎作用和主要抗炎组分研究

摘要

psorio - cm02是广东省中医院临床治疗银屑病的中药方剂psorio - cm01的优化配方。以往的研究表明，它在抗炎和免疫调节中发挥着重要作用。菝葜根茎(rhiza smilacis glabrae, RSG)是银屑病- cm02的一种中草药，其有效的抗炎成分是落新丁。本研究旨在检测落新妇苷和RSG在PSORI-CM02中的抗炎和免疫调节作用，我们分别使用CuSO₄诱导的中性粒细胞特异性转基因斑马鱼模型Tg (mpx EGFP):和黑色素等位基因突变的白化菌株斑马鱼模型以可视化中性粒细胞招生和巨噬细胞吞噬作用的影响。我们的数据表明，PSORI-CM02和ASTILBIN都具有抗炎作用，导致募集中性粒细胞募集和巨噬细胞吞噬作用的促进。然而，Rhizoma smilacis glabrae（没有rsg的psori-cm02）的负液也具有抗炎和促进巨噬细胞吞噬作用。结果表明，不包括RSG的公式也具有抗炎和免疫调节效果，这证明RSG不是PSORI-CM02中的主要抗炎草药。同样，阿迈尔比本用抗炎症活性成分不是配方中的主要抗炎活性成分。抗炎性和促进巨噬细胞吞噬作用对Psori-cm02的影响体内斑马鱼是多组分相互作用的结果，这是中药复方的共同特点。

1.介绍

炎症是对感染和伤害的复杂性和病理生理学级联。炎症机制也与许多疾病密切相关，包括心血管疾病，类风湿性关节炎，炎症性肠病，阿尔茨海默病，甚至癌症[1，2］．炎症过程由不同炎症细胞介导，包括中性粒细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和单核吞噬细胞[3.］．在炎症条件下，血液中的中性粒细胞向受损部位迁移[4］．此外，巨噬细胞是先天免疫系统中的主要免疫细胞，并在炎症中发挥基本作用，直接抵消有害的外部刺激。活化巨噬细胞在宿主对病原体感染的宿主防御中起重要作用，以引发吞噬活性，通过产生各种炎症介质来促进炎症反应[5- - - - - -7］．病原体，凋亡细胞和碎片的吞噬作用是脑防防御和组织稳态中巨噬细胞功能的关键特征[8］．因此，监测动物中性粒细胞数量和巨噬细胞吞噬情况是评价炎症反应的有效方法。许多疾病的发生和发展都与免疫和炎症有关。因此，具有免疫和抗炎作用的药物研究一直是研究领域的热点。

斑马鱼与形态和生理学中的哺乳动物高度相似，其胚胎的光学透明度可以使炎症的非侵入性和动态成像体内［9］．此外，表达表达中性粒细胞特异性绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼（GFP）使得可以观察中性粒细胞行为体内［4］．在炎症消退过程中，也观察到通过反向迁移以及细胞凋亡和巨噬细胞摄取来去除中性粒细胞[10.，11.］．巨噬细胞不仅参与清除组织重塑过程中产生的细胞碎片，还能及时有效地清除凋亡细胞。巨噬细胞的主要作用是清除间质环境中的外来细胞物质[12.］．因此，在第二个实验中，通过静脉注射墨水观察黑色素等位基因突变的Albino品系斑马鱼的巨噬细胞吞噬情况，从而评估药物对巨噬细胞吞噬的影响。最后，通过这两种斑马鱼模型评价药物的抗炎作用。

中药复方是中药临床应用的主要形式，通常由多种中草药组成，通过相互协调或制约在人体中发挥药效作用[13.］．PSORI-CM02是PSORI-CM01的优化公式，是国民着名医生郭伟轩的经典处方，在广东省医院的二十多年中已被用于牛皮癣的牛皮癣[14.］．银屑病cm02由姜黄、芍药、紫红、Sarcandra Glabra.，Rhizoma smilacis glabrae，和梅姆酱，被证实有消炎作用及提高免疫力[15.］．RSG是银屑病- cm02中的中药，有抗炎作用的报道，其主要有效活性成分是落新妇苷[16.］．psori-cm02还具有抗炎活动;然而，主要的抗炎组分尚不清楚。在这里，我们试图澄清RSG是否是具有抗炎作用和南岛的主要中医中药是PSORI-CM02中抗炎的主要活性成分。为此，建立了两种斑马鱼病理模型：硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型和斑马鱼巨噬细胞吞噬作用评价模型。此外，进行了相关的药效学实验以评估抗炎症作用和山雀，RSG和PSORI-CM02之间的相关性。

2。材料和方法

2.1。材料

2.1.1。仪器和试剂

六孔板(Nest Biotech，中国);解剖显微镜(SZX7，日本奥林巴斯);附在解剖显微镜上的相机(VertA1，中国);精密电子天平(美国OHAUS CP214);电聚焦连续变焦荧光显微镜(日本尼康AZ100);甲基纤维素(σ,中国);二甲基亚砜(DMSO) (Sigma，中国);中性红(西格玛，中国)。

2.1.2。实验动物

在本实验中，两株斑马鱼，转基因中性粒细胞荧光斑马鱼Tg (mpx EGFP):和黑色素等位基因突变的白化斑马鱼，被用于自然交配和繁殖。每组30条斑马鱼，购自Hunter Biotechnology, Inc.。此外，本研究还使用了受精后三天(dpf)的斑马鱼。所有斑马鱼在鱼水中保持在28°C(每升反渗透水中200mg即溶海盐，pH 6.9-7.2，电导率480-510)μ硬度:53.7-71.6 mg/L CaCO_3.）在14小时/ 10小时光/暗循环中）。实验室动物的许可证数量是Syxk（浙江）2012-0171。所有实验均按照国际AAALAC认证的要求进行。

２.２.实验药物的制备

2.2.1。提取psori-cm02液体

根据处方，8次水浸泡30分钟后提取3次，第1次1小时，第2、3次45分钟;然后用纱布过滤，与三次提取液结合，最后浓缩成提取物。使用前用10% DMSO水溶液配制母液20 mg/mL。这是A药，含落新丁:3.9216 mg/g。

2.2.2。RSG负液（Psori-cm02负液）

与部分中提到的相同操作２.２.1，但没有RSG。使用前用10% DMSO水溶液配制母液20 mg/mL。这是药物B。

2.2.3。Astilbin解决方案

称量落新妇碱，用DMSO配制母液20 mg/mL后使用。这是药物C。

２.３.斑马鱼炎症模型的建立

受精后3天的斑马鱼(3dpf)在6孔板中孵育，10μM Cuso.₄采用先进的图像处理软件进行图像分析，计算中性粒细胞数量(n）在斑马鱼的炎症部位。在模型对照组（28）和正常对照组（6）之间进行比较该数量，表明硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型成功建立（ )．

2.4。斑马鱼炎症模型中最大耐受药物A，B和C的耐受性浓度

在正式实验之前，应研究实验药物的毒性和最大耐受性浓度。基于形态学变化和中性粒细胞特异性转基因斑马鱼的形态变化和死亡数的药物A，B和C的毒性Tg (mpx EGFP):是评估．

在受精后3天，随机选取510条转基因斑马鱼，分成17组，放置在6孔板中。每孔(实验组)30尾斑马鱼，置于28℃培养箱中培养。试验开始时，将斑马鱼分别暴露于溶于水的不同浓度的药物A、B和C，每孔的容量为3 mL。将小鼠分为空白对照组、模型对照组各10只μM Cuso.₄2小时，药物A，B和C组。每种实验药物在5个浓度（药物A：250,500,1000,1500和2000）上给出 μg / mL;B：250,500,000,1500和2000 μg / mL;药品C: 125、250、500、1000和2000μg / mL)。治疗1 h后，除空白对照组外，其余各组均给予10μM Cuso.₄建立转基因斑马鱼的炎症模型。两小时后，观察到斑马鱼的形态变化和死亡率，以确定三种药物对中性粒细胞特异性转基因斑马鱼的最大耐受浓度。

2.5。评价药物A，B和C使用斑马鱼炎症模型的抗炎作用

将360尾斑马鱼随机分为12组，每组30尾斑马鱼，分别为空白对照组、模型对照组、10尾斑马鱼μM Cuso.₄2 h，阳性对照组(80μM吲哚美辛)等药物实验组。所有斑马鱼在28°C的培养箱中6孔板中孵育，每孔容量为3 mL。随后，按照本节所述的方法进行手术2．4．药物A的剂量浓度分别为222、667、2000μG / ml和药物B和C的药物为111,333和1000 μ克/毫升。经过两小时的给药后，从每组中随机选择10个斑马鱼，并在连续的ZOOM荧光显微镜下拍摄电气聚焦。药物A，B和C对CUSO的抗炎活动₄通过对中性粒细胞数量的统计分析评价炎症斑马鱼。炎症消退效应的比值根据中性粒细胞的数量计算。计算公式如下:

2.6。斑马鱼巨噬细胞函数评估模型的建立

实验采用斑马鱼巨噬细胞吞噬评价模型进行。将3 dpf黑色素等位基因突变白化株系斑马鱼静脉滴注墨水，置于28℃培养箱中孵育48小时，解剖显微镜观察并拍照。利用先进的图像处理软件分析和计数吞食墨水的巨噬细胞数量，以评价样品的效果。

2.7。斑马鱼巨噬细胞吞噬模型中药物A、B、C最大耐受浓度(MTC)的测定

在为期三天的Postfertormization（3 dpf）中，510个黑色素等位基因突变的白化菌株斑马鱼斑马鱼以与部分中的相同方式随机分成17个组2．4．它们被放置在6孔板中，每孔的容量为3ml。每孔(每浓度组)30尾斑马鱼静脉注射墨汁，建立巨噬细胞吞噬模型。分别给予斑马鱼不同浓度的水溶性药物A、B、C(药物A浓度:250、500、1000、1500、2000)μg / mL;药物B浓度：250,500,000,1500和2000 μg / mL;C药浓度:62.5、125、250、500、1000μg / mL)。同时建立正常对照组和模型对照组。正常对照组用系统水处理，模型组只静脉注射墨汁不给药。采用解剖显微镜观察斑马鱼在28°C培养箱中孵育48小时后的形态变化和死亡率。随后分析这三种药物在吞噬功能模型中的毒性，确定药物A、B、C对黑色素等位基因突变斑马鱼的MTC。

2.8。药物A、B、C对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的影响

在3dpf时，随机选择360只黑色素等位基因突变斑马鱼，转移到六孔板中。为建立巨噬细胞吞噬功能模型，每孔(各浓度组)30尾斑马鱼静脉注射墨汁。根据MTC实验结果，药物A的浓度分别为56、167、500μg/mL时，药物B浓度分别为56、167、500μg/mL时，药物C浓度分别为111、333、1000μg/mL，阳性对照药百灵胶囊浓度为15.6μ克/毫升。同时建立正常对照组和模型对照组。每口井的容积为3ml。将斑马鱼置于28°C(即3 dpf至4 dpf)的培养箱中孵育24小时后染色体内用中性的红色解决方案。在染色之后，从每组中随机选择10个斑马鱼以观察，照片和在显微镜下保持图片。Nikon NIS-Elements D平均3.10先进的图像处理软件用于统计分析斑马鱼的吞咽墨水。斑马鱼中巨噬细胞（n）的数量由平均值表示，并通过统计显着性评估斑马鱼中巨噬细胞吞噬功能的影响。用于计算测试样品对斑马鱼巨噬细胞吞噬作用的效果的公式如下：

2.9。统计分析

所有数据均以平均值±标准误差(SE)表示。各组间的显著差异用邓尼特氏量表测定t-检验和方差分析。的值被认为具有统计学意义。

结果

3.1。药物A，B和C的MTC在斑马鱼炎症模型中

在进行药物A、B、C的抗炎活性检测之前，先对实验药物进行毒理学评价。2小时后，观察并记录斑马鱼的死亡数量和毒性，评价药物A、B和C的毒性，确定最大剂量浓度(MTC)。结果表明，在以下药物浓度范围内(A: 250-2000)斑马鱼均未死亡μg / mL;B：250-2000. μg / mL;C：125-2000 μg / mL)(表1)．但是，在1500和2000剂量时μG / ml药物B，斑马鱼对刺激不敏感，它们的毒性反应比模型对照组更严重。因此，药物B的最大剂量浓度为1000 μ克/毫升。当药物C的浓度为1500和2000时 μg/mL时，发生药物沉淀，故设药物C的最大剂量浓度为1000μ克/毫升。根据实验结果，以下浓度的药物，药物A：222,667和1000μg / mL;药物B: 111, 333和1000μg / mL;药物C: 111, 333和1000μ选择G / ml，用于后续实验。

3.2。评估斑马鱼炎症模型的药物A，B和C的抗炎作用

由于硫酸铜可诱导听觉细胞损伤，引起炎症反应，中性粒细胞在炎症部位积聚，从而建立炎症细胞模型。本实验采用cuso4诱导斑马鱼炎症模型，评价三种药物的抗炎作用。如图所示1，许多荧光中性粒细胞被招募到cuso4诱导的斑马鱼的炎症部位。在cuso4诱导的斑马鱼模型中，炎症部位荧光中性粒细胞的平均数量为28±1，而在cuso4诱导的幼鱼模型中，炎症部位荧光中性粒细胞的平均数量为222、667和2000μg/mL时，A药物浓度分别为10±1、17±1、15±12)．同样，111、333和1000处理过的斑马鱼炎症部位荧光中性粒细胞的平均值μg/mL药物B分别为10±1、10±1、17±1，治疗人数111、333、1000μg/mL分别为13±1、11±1、7±1。炎症消退率见表2．实验结果(图2和图3.)表明A、B、C三种药物均具有不同程度的抗炎活性，且A、B两种药物低浓度时的抗炎效果优于高浓度时，且优于阳性对照药。C药的抗炎作用也优于阳性对照药，且呈剂量依赖性。

３．3.A、B、C药物在斑马鱼巨噬细胞吞噬模型中的MTC

如表所示3.另一种是斑马鱼，分别注射了250和500毫克μg/mL的药物A和B均无明显毒性表型。药物A在浓度为1000 1500 2000时的死亡率μG / ml分别为23.3％，46.7％和96.7％。在250和500 μg/mL的药物B，斑马鱼没有死亡。此外，1000、1500和2000年的死亡率分别为70%、100%和100%μg/mL，故药物A和药物B的MTC浓度均为500μ克/毫升。此外，剂量为62.5-1000μG / ml药物C未引起斑马鱼的发育阶段的任何毒性作用，但是当药物C的溶解浓度超过1000ug / ml时，它沉淀出来，使得最大剂量的药物C为1000 μ克/毫升。

基于上述实验结果，以下浓度：药物A：56,167和500 μg / mL;药物B：56,167和500 μg / mL;药物C: 111, 333和1000μg/mL，用于后续实验。

3.4。Zebrafish巨噬细胞吞噬吞噬作用A，B和C

在建立斑马鱼巨噬细胞的吞噬功能模型并赋予药物24小时后，从斑马鱼的两耳观察巨噬细胞吞噬墨水的数量，如图所示4．阳性组和药物A、B、C低、中、高剂量组吞噬墨水的巨噬细胞数量如图所示5，促进吞噬作用的巨噬细胞如图所示6和表格4．结果表明，三种药物A，B和C全部促进了实验浓度以巨噬细胞的吞噬作用。药物A对斑马鱼巨噬细胞的吞噬作用促进效果与剂量正相关。药物B和药物C的效果是中剂量中最好的，而药物A在高浓度基团中的效果和培养基中的药物C优于阳性对照组。药物B在培养基浓度基团中的效果与阳性对照组中的影响类似。

4.讨论

“多成分、多渠道、多靶点”是中药复方治疗疾病的特点和优势[17.］．TCM化合物的功效通常是多种组分协同效应的结果，这也反映在该实验的结果中。Psori-cm02是我们医院的牛皮癣的代表性草药配方。早期进行了许多临床和实验研究，抗炎研究结果表明，PSORI-CM02可以抑制促炎细胞因子如TNF的mRNA表达α、IL-6和IL-17，并降低血清蛋白水平[18.］．RSG是银屑病- cm02中的一种中药，已有报道具有抗炎活性，其主要生物活性成分是落新妇苷[16.，19.］．为了探讨RSG与PSORI-CM02在抗炎作用中的相关性，我们进行了本实验。

炎症是先天性免疫系统的一种生理反应，其目的是减少导致组织损伤的致病因素和/或最大限度地减少外部影响，诱导适当的伤口愈合，并恢复组织稳态[20.］．当炎症反应开始时，中性粒细胞和淋巴细胞在早期被招募，随后巨噬细胞在后期被强烈激活[1］．但是，如果身体无法解决急性炎症反应，它会发展成慢性和持续炎症[21.］．据报道，中性粒细胞参与了分解慢性炎症的适应性免疫应答，并涉及单核细胞/巨噬细胞在急性炎症反应中的参与[22.］．为了解决炎症，必须通过经历细胞凋亡和巨噬细胞吞噬或通过反向迁移将炎症区域留下来有效地清除中性粒细胞[23.- - - - - -25.］．

中性粒细胞实验中，用硫酸铜损伤中性粒细胞，使斑马鱼听觉细胞发出荧光，引起炎症反应。计算炎症部位(斑马鱼外侧位置，即接近斑马鱼听觉细胞)中性粒细胞的数量。在墨水吞噬巨噬细胞实验中，用中性红染色，计数斑马鱼头部巨噬细胞的数量。这两个实验都是在显微镜下进行的。该方法操作简单，实验结果直观。可以准确获得炎症部位吞噬墨水的中性粒细胞和巨噬细胞的数量。因此，研究炎症部位的中性粒细胞数量和巨噬细胞吞噬能力可以作为评价药物抗炎活性的有效方法。

近年来，作为模型生物，斑马鱼有许多优点，如透明的胚胎，体积小，喂养，快速发展，同时和直接观察药物对多种组织和器官的影响，以及小样品剂量。它们广泛用于毒性和药效学研究[26.］．利用斑马鱼胚胎的透明特性，可以在显微镜下观察炎症细胞的行为，研究药物的抗炎作用。在本实验中，CuSO₄用于诱导斑马鱼的听觉细胞损伤以建立炎症模型。实验结果表明，药物A，B和C可以抑制中性粒细胞对炎症部位的聚集。药物A和B的抗炎作用在低剂量中更好，两种药物的抗炎作用相等，而药物C的抗炎作用在高剂量中更好。评估药物A，B和C对巨噬细胞吞噬作用的促进作用表明，药物A，B和C都促进了对巨噬细胞吞噬作用的影响。

结果表明，在不含RSG的情况下，PSORI-CM02具有抗炎活性，且其抗炎活性具有可比性。落新妇苷(药物C)的抗炎活性与剂量呈正相关，111 ug/mL时炎症缓解率仅为53.6%，低于低浓度A药物(含落新妇苷0.8706 ug/mL)的64.3%。即使不添加RSG, PSORI-CM02仍具有相同的抗炎作用，说明落新丁具有抗炎作用，但并不是PSORI-CM02抗炎作用的主要有效成分。在巨噬细胞吞噬功能评价实验中，药物A的促进作用强于药物B，但差异不明显。500 ug/mL A药(落新妇苷含量为1.9608 ug/mL)与333 ug/mL落新妇苷具有相同的促进作用。同样，实验也证明落新妇苷不是银屑病- cm02的主要有效成分，而只是有效成分之一，体现了中药复方多组分协同作用的特点。

在预实验中，我们测定了药物A、B、C对斑马鱼的最大给药剂量。在抗炎模型中，药物A、B、C均有较小的副作用。A药的最大给药剂量为2000μg/mL, B、C药物的平均剂量为1000μ克/毫升。在MTC浓度下，三种药物对斑马鱼均无不良反应。巨噬细胞吞噬模型:500μg/mL的药物A和B和1000μg/mL的C为最大给药剂量(考虑溶解度因素)。正式实验中，在MTC浓度范围内建立多个浓度组，分别评价抗炎模型和巨噬细胞吞噬模型的药物安全性。

综上所述，本研究首次研究了PSORI-CM02的抗炎作用以及RSG与PSORI-CM02的相关性体内斑马鱼型号，并提出了Psori-cm02，psori-cm02负药物和山雀才能缓解cuso₄- 特异性转基因斑马鱼中的刺激炎症反应，这可以减少对损伤部位的中性粒细胞募集数量。此外，观察到巨噬细胞吞噬墨的数量的增加，表明它们还可以促进巨噬细胞吞噬作用。南·南霉素具有抗炎作用，但南霉素单体的浓度远高于PSORI-CM02中含有的南霉素的浓度，即使从PSORI-CM02中除去山雀（RSG），它对抗炎症几乎没有影响psori-cm02的影响。上述结果表明，其他组分在化合物中也具有抗炎作用。具体情况需要进一步深入研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

谢谢杭州猎人生物科技有限公司在这项研究中得到了帮助。本研究得到广东自然基金项目（2017A030313733）和广东科技部门基金项目（2016A020215195）。

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