静脉注射脂乳剂对人血浆和血浆中游离和局部麻醉浓度影响的体外分析

抽象的

背景．静脉脂乳剂(ILE)被推荐作为局部麻醉(LA)毒性的“抢救”治疗。一种据称的作用机制表明，亲脂性LAs被隔离到血管内的“脂沉”中，从而降低游离药物浓度。关于ILE对LAs的影响，现有的数据有限。目标．比较ILE在体外对人血/血浆中LA浓度的影响，并将这种降低与LA亲脂性联系起来。方法．四种LAs中的一种(布比卡因-最亲脂- 4mg /L，罗哌卡因- 6mg /L，利多卡因- 14mg /L，普里洛卡因-最小亲脂- 7mg /L)被添加到血浆或全血中。添加了ILE或控制缓冲区。血浆离心分离ILE，从无脂馏分中测定总la浓度。全血均衡透析，测定游离la浓度。与对照组相比，LA浓度降低的百分比与亲脂性相关。结果．与其他LAs相比，ILE使总布比卡因和游离布比卡因浓度显著降低。尽管罗哌卡因的亲脂性与布比卡因相似，但其浓度降幅最小。当罗哌卡因被排除在分析之外时，LA浓度的降低与亲脂性的增加相关。结论．在该第一体外模型中，评估在人血/等离子体中暴露于ILE的自由和全氧化物浓度，ILE效应与增加除Ropivacaine的所有嗜合素的嗜好性线性相关。

1.介绍

局部麻醉(LAs)通常用于急救医学和麻醉实践。不小心全身给药可能导致局部麻醉全身毒性(LAST)，表现为恶性心律失常、心脏骤停和/或神经毒性。这些可能是传统复苏治疗的顽固性。

静脉脂肪乳剂(ILE)是乳剂中脂肪分子的不均匀混合物，通常用作肠外营养剂。基于之前的体外和体内研究表明，ILE对布比卡因的心脏毒性有积极作用，目前推荐作为所有洛杉矶药物LAST的解药。目前，多个国家的麻醉学院认可ILE作为疑似LAST抢救后标准复苏治疗的辅助治疗[1］．

ILE在LAST中的作用机制一直存在争议。最被广泛接受的机制提出，它提供了一个“脂沉”或血浆内的腔室，亲脂药物被隔离到其中[2］．理论上，这导致无血浆药物浓度降低，导致浓度梯度远离毒性表现明显的靶组织。鉴于不同LA的脂溶性不同，与ILE的结合程度可能随LA的不同而不同。在体外和体内药物毒性模型以及临床环境中，ILE结合LA药物的有效性还存在知识差距。

2.材料，方法和方法

这是一项基于实验室的非盲法体外评估ILE对(1)人血浆中总la药物浓度和(2)全人血液中游离la药物浓度的影响。

2．1.材料

人类全血和血浆由澳大利亚红十字会血库捐赠，南岸，墨尔本，维多利亚州。

使用的局部麻醉剂是Bupivacaine 0.5％（Bupivacaine，Pufizer，West Ryde，澳大利亚），Lignocaine 1％（Xylocaine，Astrazeneca，North Ryde，Australia），Prilocaine 0.5％（Cittanest，Astrazeneca，北Ryde，澳大利亚），和罗哌卡因0.5％（Naropin，Astrazeneca，北Ryde，澳大利亚）。基于文献报告的浓度与具有显着的心血管或中枢神经系统毒性或死亡率相关的浓度，确定药物浓度导致La毒性[3.］．表中总结了这些问题1具有特定LAS的相关药代动力学参数。

Ile是一种商业上可获得的产品，提供Introalipid的20％（Fresenius Kabi Australia Pty Limited）的20％配方。

用于测定全血的自由药物浓度的平衡透析实验所需的快速平衡装置和相关的底板是来自Thermo Scientific，Pierce Research，Rockford，IL，USA。

２.２.人血浆中LAs总药物浓度的评估

人血浆中加入布比卡因、普罗卡因、罗哌卡因或利多卡因的一种。对于每种LA试剂，实验进行了3个重复。由于我们之前已经确定，当试图从血液相中分离脂质相时，离心会导致红细胞溶血，所以使用的是人血浆而不是全血。

首先，在浓度接近4mg /L时，对所有药剂进行ILE对LA浓度的影响评估。第二组检测是使用更高的LA浓度的丙洛卡因、罗哌卡因和利多卡因，以接近报告的与心脏骤停相关的严重LAST病例的血清浓度。实验所用药物浓度汇总见表1．

使用临床血液气体分析机分别为7.2,7.0和6.0，测定人血浆，血液和鞘内的pH值。

向含有LA的血浆样品中加入胰蛋白酶20％或磷酸盐缓冲盐水（PBS），以在三个浓度-2％（20）以上的最终总体积为1ml（20 μ.L /毫升),10% (100μ.L/mL)， 20% (200μ.L /毫升)。

样品被允许在温度控制的轨道振动器(Lomb Scientific，澳大利亚)上在60 rpm和37°C下平衡30分钟。然后样品在13000 rpm和37°C的温度下离心1小时(Eppendorf离心机5115 R, Thermo Fisher Scientific, Australia)。样品的血浆部分从脂层上清仔细吸出，然后冷冻并储存在−20°C，以便稍后在维多利亚法医学研究所(VIFM)进行批量分析。

２.３.平衡透析法测定不同浓度ILE全血中游离药物浓度

只有较高的La浓度用于整个血液测定（表1）.将ILE或PBS以与血浆实验相同的浓度加入到最终体积1 mL中。经血气机测定，贮存全血的pH值为7.0。在将样品放入快速平衡透析(RED)室之前，在轨道摇床上37°C孵育30分钟。

使用RED设备进行平衡透析。这些方法以前已经在全血游离药物浓度分析中得到验证[4］．该装置由由透析膜分开的两个旁面腔室组成。一个腔室含有样品，并且相邻的室含有样品缓冲液。将红色器件放置在基板上的腔室中，其中可以同时进行多种测定。

在这些实验中，PBS被用作缓冲腔中的透析液。将含有LA的血液与ILE或PBS孵育，并将等量的PBS引入相邻的腔室。

样品在37℃下孵育6小时，使血液中未与血浆蛋白结合的游离药物与缓冲腔中的PBS达到平衡。缓冲腔内测量的药物浓度反映了血腔内的游离药物浓度。孵育后，每个腔体的内容物被吸入并在−20°C下冷冻，以便后续批次分析。

2.4。药物浓度测定

在维多利亚型法医学研究所（VIFM），通过标准提取方法制备样品用于药物浓度分析。解冻后，将它们混合在迷你涡旋上5秒钟。混合后，180 μ.每个样品的L转移到新的样管中。同样,160年μ.每个校验剂(血浆或全血样本，用血液、ILE或PBS制成最终体积为1 mL;在VIFM中用标准已知浓度的药物加标)转移到新的样管中。内部标准是20μ.在所有样品和校准器中以1mg /mL的浓度加入L的三甲嘧啶。

每局部麻醉剂的储备溶液由已知的浓度（Bupivacaine 4mg / L，Lignocaine 4和14mg / L，胰腺4和7mg / L，以及Ropivacaine 4和6mg / L）和20 μ.L被添加到每个校准样品中。此时，所有样本的总容积为200μ.l在每个Eppendorf管内。

将Trizma缓冲液（0.2mL）和1-氯丁烷（1mL）加入到样品中，并彻底混合。这些溶剂通过使等离子体蛋白质和裂解红细胞释放蛋白质结合药物来从样品中提取药物。在2500rpm的VXR基本Vibrax振荡器（Sigma Aldrich，Sydney，Australia）上提取样品10分钟，然后以13,000rpm离心5分钟。将含有药物的透明溶剂层转移到清洁的玻璃自瓶仪小瓶中。将小瓶蒸发至干燥的羽绒样品浓缩器（Thermo Fisher Scientific，Boronia，Australia）蒸发20分钟。然后在100中重构样品 μ.L的甲醇。

利用气相色谱质谱（GC-MS）测定药物浓度，验证的技术可用于测定局部麻醉剂的可靠检测[5］．使用GC-MS QP2010系列（Shimadzu，Australia）分析制备的样品。GC-MS为每个样品产生质谱峰。使用每个药物的峰面积比和各自提取的校准曲线计算浓度。

2.5。数据收集分析与统计

所有实验都重复进行三次，并将结果输入Excel电子表格。使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Ltd)对结果进行图形表示。

将每种药物的La浓度的百分比进行比较，每个ILE浓度都是总和的总和和游离药物浓度实验。这些以图形方式报告为平均值±SEM。使用具有Bonferroni后测试分析的单向ANOVA对每个ILE浓度进行比较了La浓度降低百分比的差异。

最后，ILE处理后总la和游离la浓度降低百分比与各自亲脂指数之间的相关性使用较高的La浓度数据在GraphPad Prism中使用线性回归分析进行。

3.结果

3.1。Ile对人血浆中总药物浓度的影响

在三种ILE浓度下，血浆中总布比卡因浓度随着ILE的下降幅度最大，平均下降幅度约为60%。在每一脂质浓度下，与其他LA药物相比，布比卡因的降低率有统计学意义(图)1）.在三种ILE浓度下，布比卡因的浓度降低到相似的程度。在较高的血浆浓度下，与其他药物相比，LA的浓度有更大的降低。值得注意的是，在高浓度时，罗哌卡因的血药浓度下降最小。

3.2。ILE对使用平衡透析的人类全血免费药物浓度的影响

在所有ILE浓度下，与其他LA药物相比，布比卡因的药物浓度下降百分比在统计学上显著降低(图)2）.从血浆实验中可以看出，在所有ILE治疗组中，所有LA药物浓度的降低是一致的，且不随ILE浓度的增加而增加。

值得注意的是，在任何ILE组中游离罗哌卡因的浓度都有最小程度的降低。这与在使用较高毒性浓度的血浆实验中观察到的罗哌卡因总浓度的结果相一致。

３．３．LA浓度的变化及其与亲脂指数的关系

我们用图表比较了药物浓度较高时LA浓度的下降百分比与每种药物的亲脂指数．

将四种药物全部纳入时，血浆总药物及透析后血液游离药物的亲脂指数升高与药物浓度无关(图)3(一个)和3 (b)）.布比卡因的药效最强对总药物浓度和游离药物浓度影响最大。罗哌卡因并没有遵循其相对高亲脂性所预期的线性趋势。

脂肪帕纳克排除，对脂质诊断与药物浓度降低百分比进行了分析。在增加之间观察到线性相关性使用线性回归分析剩余三种LAS的药物浓度降低（图3（c）和3（d））.

4。讨论

我们分别描述了不同浓度的ILE对人血浆和全血中总la和游离la药物浓度的影响。值得注意的是，这是第一个在使用人类血液产品的模型中检测LAs总药物浓度和游离药物浓度的报告。

与其他LAS相比，Bupivacaine表现出总共和自由药物浓度的百分比最大。在所有浓度评估的ILE中，这与Ile评估并与之相关的浓度相关，这是测试的最亲脂性。与其他LAS看到类似的，尽可能不太重要的效果。然而，令人惊奇地，罗哌卡因令人惊讶地展示了血浆药物浓度的最小降低，并且尽管具有测定的LAS的第二高亲脂性指数，但是在游离药物浓度的情况下仍然非常低廉。

当比较ILE处理后LA浓度的降低和各药剂的亲脂性指数时，我们最初并没有观察到这两个参数之间的线性相关性。然而，如果罗哌卡因的数据被排除在分析之外，那么其他LAs的线性相关性是明显的。

选择第一浓度ILE是因为它接近1.5 mL/kg脂肪内酯负荷剂量后在体内可能达到的血液浓度。这大约相当于人体血浆总容量的3.5%。10%的浓度用于近似血液中ILE的浓度，在加载剂量和随后的进一步输注300-400毫升脂内酯后可能会看到，如指南中所推荐的http://www.lipidrescue.org.．20%的浓度可能是只有在临床环境中静脉注射1升以上的ILE时才能达到的浓度。

其他使用非la亲脂药物的体外研究表明，亲脂性和ILE对药物浓度的影响之间存在正相关[6，7］．然而，在我们的研究中，Ropivacaine的结果与增加亲脂性和ILE结合之间的关联不一致。Ropivacaine具有测试的LAS的第二大亲脂性指数。如果在减轻La毒性中的ILE效应的主要机制是药物螯合到脂质阶段，则预期罗哌卡因将使ILE将ILE结合到比观察到的程度更大。以前的研究检查ILE对缓冲溶液中Ropivacaine浓度的影响还观察到，罗比卡因浓度的降低虽然具有Bupivacaine，但尽管有类似的亲脂性指数6，8，9］．Mazoit等人。[8]观察到1% ILE处理缓冲溶液中布比卡因浓度降低60%，而同一缓冲模型中罗哌卡因浓度降低30%。类似地，Evans等人[9在加入ILE后，在加入ILE之后，浓度降低了40％，而Ropivacaine与ILe结合的变化更可变，并且减少约20％。法语等人。[6]检测三种LAs(布比卡因、罗哌卡因和甲哌卡因)与ILE混合后浓度的下降。本研究发现，尽管甲哌卡因的辛醇/水系数(1.9)低于罗哌卡因(2.9)，但布比卡因、罗哌卡因和甲哌卡因的LA浓度分别下降了18%、7%和12%。这些观察结果与我们的结果一致。

我们没有将血浆或血液的pH维持在正常的生理范围内。我们使用的储存血液和血浆的pH分别为7.0和7.2。如其他体外模型所见[8， pH值下降可能与ILE与LAs结合效果降低有关。Mazoit等人注意到，当pH从7.4降低到7.0时，脂乳对罗哌卡因和布比卡因浓度降低的影响也同样降低了[8］．因此，在较低的pH值下与ILE结合可能同样影响了四个LAs，因此不会改变ILE在本报告中测试的LAs中的相对效果。在伴有心脏骤停或严重低血压的LAST临床情况下，患者经常伴有酸中毒。因此，我们认为在学术环境中探索脂质与LAs的结合是很重要的，以便更密切地复制可能的临床状态。考虑到我们的系统维持在低于生理pH的水平，这可能解释了罗哌卡因与ILE结合的不良结果。然而，这也可能表明ILE在患有酸中毒的患者中可能效果不佳。

布比卡因和罗哌卡因的药代动力学特征相似，但罗哌卡因的体积分布更大(见表)1）.这种药代动力学性能不会影响体外模型的结果，不太可能解释用罗哌卡因所见的结果。

ILE在布比卡因毒性中的作用机制已经提出了不同的理论。首先，布比卡因抑制线粒体酰基肉碱转移酶活性，并抑制游离脂肪酸(FFAs)进入这些细胞器。理论上认为，通过ILE给药提供更高的细胞外浓度的FFAs可以增加FFAs到心肌和细胞功能的输送[10］．其次，ILE中发现的FFAs已被证明可以抑制布比卡因与心肌细胞电压门控钠的结合⁺-通道，减少这种LA对使用依赖的离子通量的阻断和抑制[11］．这两种机制都可以解释ILE对布比卡因毒性的积极作用。然而，在包括罗哌卡因在内的其他药物引起的LA毒性中，这些机制均未被研究过，目前尚不清楚这些药物的ILE是否对心肌施加了类似的机制。有病例报告称利多卡因、普罗卡因、罗哌卡因和其他LAs在LAST中使用ILE。在大多数病例报告中，ILE治疗的指征、时间和反应没有很好地记录[12，13］．

结论

在这个体外模型中，布比卡因是最亲脂的LA，与其他LA相比，ILE处理后总药物浓度和游离药物浓度降低最大。尽管具有类似的亲脂性，但当暴露于脂乳液时，罗哌卡因的浓度并没有降低到类似的程度。本研究提示LA浓度的降低与药物亲脂性的增加存在相关性;但并不能证明ILE在LA中毒中的作用机制为因果关系。

缩写

气相:	气相色谱质谱法
ILE:	静脉注射脂肪乳剂
洛杉矶：	局部麻醉
：	药物在辛醇和水中的亲脂分配系数的对数表达式
PBS：	磷酸缓冲盐
红色的：	快速平衡透析
VIFM:	维多利亚州法医学研究所。

伦理批准

该研究被莫纳什大学人类研究和伦理委员会批准为低风险研究项目。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Louise Clark负责文献检索、样品制备、药物浓度测定及数据分析、论文撰写等工作。Andis Graudins是该研究的主要主管，他设计了该研究，监督了实验室程序，获得了该研究的伦理批准，分析了数据，审查了论文。约亨·拜尔(Jochen Beyer)是第二主管，负责指导和教授药物分析方法和开发，分析数据，审查论文。所有作者阅读并批准了最终论文。

致谢

作者感谢Qerime Alimovski在样品制备和提取方面的帮助。作者获得了莫纳什大学的内部资助。这项研究没有从任何公共、商业或非营利部门的资助机构获得具体的资助。

参考文献

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版权

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