苦参酸及其提取物的作用Callistemon Citrinus.论细胞外蛋白酶的生产金黄色葡萄球菌

抽象的

金黄色葡萄球菌是常见的医院病原体。抗生素已被用来治疗S.金黄色葡萄球菌感染。然而，与耐药菌株有关的死亡率增加S.金黄色葡萄球菌．细胞外蛋白酶涉及负责过渡的负责S.金黄色葡萄球菌从粘性病原体变成侵入性病原体。耐药菌株的发展使寻找新的药物来源成为必要。植物传统上被用作治疗分子的来源。本研究的目的是确定苦参酸及其提取物的作用Callistemon Citrinus.论细胞外蛋白酶的生产S.金黄色葡萄球菌．采用微量稀释法测定苦参酸及其提取物的抑菌效果S.金黄色葡萄球菌．两种提取物显示出最小抑制浓度（MIC）值为50 μ.克/毫升。水：乙醇（50：50）和二氯甲烷：甲醇（50：50）萃取液被杀菌对S.葡萄球菌浓度为100 μ.微克/毫升和50 μ.胃肠/ ml分别。使用蛋白酶测定研究了致白碱酸和提取物对细胞外蛋白酶产生的影响。测量蛋白水解活性（PR）区域作为菌落的直径与水解区域的总直径的比例。提取物减少了细胞外蛋白酶的产生，而折磨酸完全抑制细胞外蛋白酶的产生S.金黄色葡萄球菌．扭酸的Pr值为1。二氯甲烷甲醇提取物和水乙醇提取物的Pr值分别为0.92和0.84。综上所述，苦参酸能抑制细胞外蛋白酶的产生;因此，有必要探索其在抗毒治疗中的应用S.金黄色葡萄球菌感染。

1.介绍

严重的增加金黄色葡萄球菌耐药菌株引起的感染[1］．这种感染的增加部分归因于细菌的蛋白酶的过度分泌[2］．细菌用细胞外蛋白酶用于抵抗抗生素，在与宿主先天免疫系统的相互作用期间存活和皮肤脓肿的形成以及毒力决定符稳定性的效果。研究表明S.金黄色葡萄球菌缺乏蛋白酶基因的菌株降低了脓肿形成和器官侵袭的受损[3.］．需要细胞外蛋白酶在富含肽的环境，血清和血液中的细菌生长以及抗微生物肽存在下。细胞外蛋白酶随着蛋白质如弹性蛋白的蛋白质而增加细菌的侵袭性。弹性蛋白的切割使细菌进入器官和血液中，允许细菌扩散到身体的不同部位。细胞外蛋白酶还有助于通过人白细胞抵抗吞噬作用[4.］．茄子等蛋白酶能够切割人酱油，因此赋予细菌对该蛋白质的抗性[1］．

这一机制的S.金黄色葡萄球菌细胞控制毒力因子的产生是通过分泌蛋白酶的作用[4.］．细胞外蛋白酶与毒素和其他外酶一起产生以控制其稳定性[5.］．得到的稳定性有利于致病因子的协同滴定，以适应小众的具体情况。因此，因为它们控制其他毒力因子的协同表达胞外蛋白酶可以被认为是毒力的主调节器[6.］．抑制细胞外蛋白酶的产生可导致其他毒力因子的表达减少。Callistemon Citrinus.通常被称为瓶刷，因为它的圆柱形花刷广泛分布在温带地区，特别是在澳大利亚、南美洲和热带亚洲[7.]并对津巴布韦异乎寻常。C. Citrinus.属于家庭myrtaceae.．的不同部分C. Citrinus.在民间医药已用于治疗腹泻，痢疾，风湿病和支气管炎。以前的工作开展了C．辣椒素导致分离和鉴定三种化合物，即张力酸，桦木酸和23-羟基甲酸-12-24-oIc。难以酸是最丰富的分离化合物，百分比的粗产物的产率为1.3％[8.］．致白肌是一种三萜，已被证明具有抗微生物，抗真菌，抗炎和抗肿瘤活动[9.］．粘性酸还被证明具有肝脏保护作用，防止乙酰氨基酚过量引起的肝损伤。难以抑制通过乙酰氨基酚overdose诱导的反应性氧物质的产生[10.］．本研究测定了苦参酸及其两种提取物的抑菌作用C．辣椒素对S.．葡萄球菌．本研究的目的是确定睾酸的影响，孤立C．辣椒素在先前的研究，并通过来自相同植物两种提取物在生产胞外蛋白酶的S.．葡萄球菌．

2。材料和方法

2.1。试剂和化学品

本研究中使用的所有化学品都是分析级，并从Sigma-Aldrich（Steinheit，德国）获得。这些包括二甲基磺砜（DMSO），环丙沙星，脱脂乳粉，3-（4.5-二甲基噻唑-2-基）-2.5-二苯基四唑溴（MTT），LURIA肉汤碱和LURIA琼脂。

2.2。微生物应变和培养基

S.金黄色葡萄球菌ATCC 9144是从博茨瓦纳大学(博茨瓦纳哈博罗内)生物科学系微生物科获得的。细菌在−35°C下作为甘油储存。在37℃条件下，细菌在罗瑞亚琼脂上培养24 h，然后接种罗瑞亚培养液。接种量调整至10^6.C.f.u / ml使用McFarland标准。

2.3。植物材料的收集和制备

C．辣椒素叶子，优惠券号码UZ2 E7是从Harare收集的（津巴布韦大学：16.8^O.S，31.1167.^O.e）。叶样品由分类师进行验证，国家植物征和植物园，津巴布韦的国家植物标本和植物园和植物园的Christopher Chapano先生。在运行自来水下洗涤叶子以除去土壤和粉尘颗粒，并在50℃下在烘箱中干燥。通过砂浆和杵将叶片研磨成细粉末，进行植物提取物的制备。将大约50g粉末置于塑料烧杯中，500ml为50：50（v / v）DCM：加入粉末中的甲醇。通过将500mL 50：50（V / V）水中的50g粉末放置50g粉末来制备第二个样品。冷浸渍方法用于从粉末叶中提取植物化学物质。将得到的混合物通过No.1 Whatman滤纸过滤并使用旋转蒸发器Rii（Buchi，Labortechnikag，瑞士）在真空下浓缩。将萃取物干燥至来自风扇的冷空气流的恒定质量，从风扇中烟罩柜。将所有提取物储存在-4℃的无菌离心管中直至使用。

2.4。筛选抗菌活性

最小抑菌浓度（MIC）使用的（3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5-二苯基溴化四MTT法测定。该测定法是用于测量MTT还原的酶的活性的比色法为甲，在代谢活性细胞给予紫色[11.］．将植物提取物溶解在DMSO终浓度为2.5％，并在水中稀释至所需浓度为12.5,25,50和100μg/ mL，进入96孔微量滴定板中。文化S.金黄色葡萄球菌（100. μ.l）最终浓度为1×10^6.c.f.u /毫升加入到每个孔中。环丙沙星用作阳性对照，并Luria液体培养基中的2.5％DMSO中的溶液作为阴性对照。Microtitre plates were incubated for 24 hrs at 37° in a Lab Companion incubator (Jeio Tech. Co. Ltd, Seoul, Korea) under a closed humidified atmosphere. The growth of cells was quantified using a Genios Pro microplate reader (Tecan Group Ltd Mannedorf, Switzerland) using the change in optical density at 590 nm before and after 24 h incubation. As an indicator of growth, 25 μ.将L 2mg / ml MTT加入到每个微量滴定板孔中并孵育2小时。观察到紫色颜色，其中细菌生长，观察到没有生长的黄色。然后将麦克风确定为显示没有生长的最低浓度。从麦克风板测定最小杀菌浓度（MBC）。为了确定MBC，使用来自MIC微量滴定板的样品。从微量孔孔中收集浓度小于或等于MIC的浓度。将样品均一式两份地涂覆到Luria琼脂上，并在37℃下在37℃下孵育24小时后评价细菌生长。未经生长的提取物的最低浓度被认为是MBC。

2.5。致白碱酸和提取物的影响C. Citrinus.关于细胞外蛋白酶生产

本测定方法采用Vijayaraghavan和Vincent [12.]有修改。A volume of 400 ml of skimmed milk agar was prepared by dissolving meat extract 1 g/L, peptone 5.0 g/L, sodium chloride 8.0 g/L, agar 15 g/L, and skimmed milk 15 g/L. A mass of 0.006 g of bromocresol green dye was added. The solution was sterilised by autoclaving in an Accu Steriliser autoclave (VWR Scientific products Co., USA). A final concentration of 100 μ.G /ml苦酸，100μ.G /ml水:乙醇提取物，50μ.添加G / ml DCM：加入甲醇提取物，将含有30mL培养基的离心管分开。用浓度为25的阳性对照用作硫氧化物。 μ.克/毫升。对于负控制板，500 μ.将L的DMSO加入液体琼脂中。将琼脂分别倒入六个标记的培养皿中，并使其固化。S.金黄色葡萄球菌使用Luria Brooth稀释细胞以浓度为1×10^8.c.f.u / ml。一个体积为5 μ.将L的细胞分布在琼脂平板上。将板在37℃温育48小时。为了确定蛋白酶活性，测量细菌菌落周围的菌落直径和间隙区域。测量蛋白酶活性（PR）作为如下式中计算的菌落直径与菌落加水区的总直径的比率：

3。结果与讨论

３.１.提取制备C. Citrinus.

从叶子中制备两种提取物C．辣椒素．水：乙醇提取物与DCM：甲醇提取物的产率较高9.4％的百分比产率较高为1.6％。水的溶剂混合物：乙醇具有提取各种植物化学物质的潜力[13.］．使用这种溶剂混合物可以提取的植物化学物质包括黄酮类化合物、皂甙、酚对苯二酚、甾醇和生物碱。除此之外，水被认为是一种万能溶剂，因为它能溶解各种不同的分子。这是因为水有能力与其他分子形成氢键。水分子在氧原子和氢原子上有极性排列。在一边，氢带正电荷，在另一边，氧带负电荷。这使得水分子被许多不同类型的分子所吸引[14.］．

3.2。对生长提取物和Tormentic酸的影响S.金黄色葡萄球菌

提取物的影响C. Citrinus.和折磨人的酸S.金黄色葡萄球菌使用肉汤微泡测定测定。两种提取物都显着抑制了生长S.金黄色葡萄球菌如图所示1．

DCM:甲醇提取物和水:乙醇提取物的抑菌率分别为97.1%和97.9%。测定了两种提取物的mic值。两种提取物C. Citrinus.是有效的生长抑制剂S.金黄色葡萄球菌麦克风值50 μ.克/毫升。浓度为100 μ.g / ml致白碱酸抑制了生长S.．葡萄球菌72.7％。这些发现与先前研究的研究结果一致，表明折磨酸对革兰氏阳性细菌施加抑菌作用[15.］．环丙沙星，阳性对照，抑制了生长S.金黄色葡萄球菌．CiProfloxacin的MIC被发现为0.125 μ.克/毫升。用电镀法测定两种提取物的MBCS.金黄色葡萄球菌暴露在25岁以下 μ.g / ml，50 μ.微克/毫升和100 μ.在Luria琼脂平板上G / ml每种提取物。两种提取物都表现出杀菌活性的杀菌活动金黄色葡萄球菌。DCM的MBC：甲醇提取物为50 μ.g / ml，而水的水：乙醇提取物为100 μ.克/毫升。存在植物化学物质或次生代谢物C. Citrinus.包括萜类化合物和生物碱[16.]可能负责观察到的抗菌活性。植物化学物质通过不同的机制施加抗菌活性。例如，单宁通过铁剥夺或与重要蛋白质的非特异性相互作用，例如酶[17.］．最有效的抗菌植物化学品C. Citrinus.据报道，叶子是由于存在的生物碱和酚类[18.］．基于来自提取物的抗菌活性C. Citrinus.和tormentic酸在该研究中观察到，无论是提取物和tormentic酸是有效的生长抑制剂。然而，提取物抑制的增长更有力S.金黄色葡萄球菌与折粒酸相比。与分离的化合物相比，提取物中的组分表现出高抗菌活性。这可能是因为，在大量化合物构成的提取物中，因此它们的抗菌活性可能涉及协同相互作用[19.］．

3.3。苦参酸及其提取物的蛋白酶抑制活性C. Citrinus.

进行蛋白酶测定以确定粘性酸和提取物的作用C. Citrinus.论细胞外蛋白酶的生产S.金黄色葡萄球菌．Pr值的参考范围改编自Elleboudy等[20.]用于解释所述蛋白水解活性。所计算出的镨值tormentic酸，提取物从C．辣椒素并且控制样品如表所示1．

结果表明1表明，在含有致白碱酸的板上没有观察到蛋白水解活性。这表明抑制了细胞外蛋白酶的产生。难题能够抑制细胞外蛋白酶的产生S.金黄色葡萄球菌;因此，不可能通过营养琼脂中的基材来消化蛋白酶。因此，折磨酸完全抑制了细胞外蛋白酶的产生S.金黄色葡萄球菌．难题是三萜类化合物，已经证明这些组分通过减少分泌蛋白质的产生而抑制细菌的生长α.- 铁蛋白，金葡萄球菌肠毒素A，和葡萄糖尿病肠毒素B [21.］．扭酸抑制蛋白酶的确切机制尚不清楚。计算机模拟提出，三萜具有合适的分子尺寸，适合于松弛单体的疏水界面位置，从而抑制蛋白酶二聚[22.］．附加到疏水相互作用，氢键还蛋白酶和羟基/在三萜骨架的羧基[之间建议23.］．由于本研究的主要目的是筛选粘性酸和提取物的抑制作用C．辣椒素上的蛋白酶的生产，在其他抑制机制进一步研究同时使用生物测定法和计算机建模需要在将来的研究中进行。观察在其上包含从提取物中的板弱和温和的蛋白水解活性C. Citrinus.，而没有观察到对阴性对照板强烈的蛋白水解活性。将萃取减少产生的胞外蛋白酶的量S.金黄色葡萄球菌．然而，与具有电池的阴性控制板上的蛋白水解区相比，这些菌落周围的蛋白质溶解区相对较小。阴性对照板没有提取物，并且观察到强烈的蛋白水解活性。这表明了S.金黄色葡萄球菌产生的细胞外蛋白酶在营养琼脂中消化基材，导致细菌菌落周围的蛋白质分区。对于水：乙醇提取物，蛋白水解活性随着提取物浓度从50增加而降低 μ.g / ml到100 μ.克/毫升。植物提取物的蛋白酶抑制归因于抑制若干生理过程中涉及的细菌蛋白酶，除了抑制剂和细胞壁之间的相互作用，或来自血浆膜之间的蛋白质，导致细胞渗透性变化并促使细菌死亡[24.］．含有环丙沙星的琼脂板被用作阳性对照，并没有显示出蛋白水解活性S.．葡萄球菌．通过称为仲裁感测（QS）的细胞间通信的过程控制和协调细菌毒力。几个革兰氏阳性细菌，如S.金黄色葡萄球菌使用Qs协调毒力因子的产生表达，包括生产细胞外蛋白酶。研究表明，一些植物化学物质可以充当批量传感抑制剂[25.］．本研究的结果表明，从中提取的植物化学物质C. Citrinus.可能表现为抑制剂，以减少细胞外蛋白酶的产生S.金黄色葡萄球菌．在100 μ.G / ml，致白碱酸显示出血液生长（72.7％）的部分抑制S.．葡萄球菌但是，通过细菌彻底抑制了蛋白酶的生产。以前的研究表明，许多对细菌的总体生长影响的许多抗菌化合物可以极大地影响S的表达．葡萄球菌毒力因子[26.］．旨在靶向细菌生长，有效的治疗策略还应该采用抗疟药或抗病毒治疗[27.]，其靶向负责发病机制和毒力的细胞过程，例如制备细胞外蛋白酶。

4。结论

从提取物C. Citrinus.和致白肌酸抑制了生长S.金黄色葡萄球菌．萃取液杀菌，而tormentic酸是抑菌。将萃取也降低了生产的胞外蛋白酶的由S.金黄色葡萄球菌，虽然折磨酸完全抑制了细胞外蛋白酶的产生S.金黄色葡萄球菌．致白肌抑制细胞外蛋白酶产生，可以作为防毒治疗来打击S.金黄色葡萄球菌感染。

数据可用性

目前的研究期间过程中产生并分析的数据集可从上合理请求相应的作者。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究是由国际科学计划（ISP）通过IPICS-ZIM01项目（国际计划在化学科学（IPICS），瑞典乌普萨拉大学），中心为新兴和被忽视疾病（CEND）的支持，以及美国加州大学，伯克利分校。

补充材料

本研究中使用的胶质酸通过叶提取物柱色谱法获得C. Citrinus.在我们的实验室之前的一项研究中[8.］．来自质谱法的化学结构，公式和数据从柱色谱中得到的级分。（补充材料）

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