SARS-COV-2包络和膜蛋白：与病毒特征有关的结构差异？

摘要

2019冠状病毒病(COVID-19)是由严重急性呼吸道冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引起的一种新型病毒感染。基因组分析表明，SARS-CoV-2与穿山甲和蝙蝠冠状病毒有关。在这篇报告中，我们描述了来自不同人类分离物的Sars-CoV-2包膜和膜蛋白与来自密切相关病毒的同源蛋白的结构比较。本文报道的分析表明，包膜蛋白和膜蛋白与穿山甲和蝙蝠冠状病毒分离物具有高度的结构相似性。然而，这些比较也突出了Sars-CoV-2蛋白的具体结构差异，这可能与跨物种传播和/或病毒特性相关。结构模型已被应用于将变异位点映射到预测的包膜和膜蛋白的三维结构上。

1.介绍

COVID-19已成为严重威胁人类健康的全球紧急情况[1那2］．缺乏关于病毒蛋白质的细节结构信息，虽然现在可获得几种SARS-COV-2蛋白质的结构信息，但有效治疗和预防策略的发展也受到严重阻碍。3.-5.］．在本报告中，描述了来自不同分离株的SARS-COV-2表面蛋白与来自密切相关病毒的不同分离物的结构比较，例如来自蝙蝠和植物蛋白的同源蛋白质。这项工作一直专注于包膜（E）和膜（M）蛋白，以及穗，形成病毒蛋白质接口到外部环境。已经广泛研究了穗糖蛋白，蛋白质数据库中有几种晶体结构[3.-6.];因此，该蛋白在本注释中并没有被特别提及。识别出与最近病毒蛋白的局部结构差异，即使是最小的差异，也可能表明突变使Sars-CoV-2能够跨物种和/或获得其特有的致病特性[7.那8.］．实际上，在科学文献中报道了许多例子，表明病毒蛋白中的单点突变甚至可以显着改变其生物学和发病机制[9.那10.］．因此，对比较研究可以揭示光侵入原产地的疫苗机制可以出现的分子机制，并且还可以提示治疗药物或逆向疫苗学实验的分子靶标。

2.材料和方法

核苷酸和蛋白质序列已从GenBank中提取[11.数据存储库。爆炸套件(12.]已被用于数据库搜索;jalview [13.]和mafft [14.]分别用于多个序列显示和对齐。通过TMHMM获得了跨膜螺旋预测[15.]，memsat [16.]，以及普罗特[17.］．CD-BIT计划[18.已用于序列聚类。同源建模依赖于Swiss-Model [19.]，Modeller [20.]或hhpred [21.]以及开源PyMOL的结构展示与分析[22.］．必要时，I-Tasser [23.已被用作AB Initio同源模型的替代来源。

结果

３.１.数据库搜索和结构建模

从GenBank数据库中，共收集到797个Sars-CoV-2完整基因组(完整列表见补充数据)。TblastN程序已被用于从每个基因组中提取E和M蛋白的序列。为了去除每个E和M蛋白组内的冗余，我们采用cd-hit聚类方法进行了100%序列同源性的聚类:将相同的序列分配到同一组中，只考虑其中一个代表进行进一步分析。Sars-CoV-2 E和M蛋白组分别被分为3和7个簇。这一发现表明，在797个基因组中，可以分别观察到3个和7个E和M蛋白变异。利用TblastN工具从GenBank中检索到密切相关病毒的E和M同源蛋白。

3.2。包络蛋白

E蛋白是保守的β-冠状病毒。在收集的SARS-COV-2 E中只发现了三种变体。序列比较表明，来自参考基因组的SARS-COV-2 E蛋白（Refseq Code YP_009724392）与Pangolin CoV MP798和BAT COV COVZXC21，CoVZC45和RATG13分离株的序列相同。数字报告的多个序列对齐1表明SARS-2-COV E变体的显着特征是在替代Glu，Gln，Asp中的位置69处的Arg的存在，其它同源SARS-COV E蛋白。该网站随后是对应于对应于其他蛋白质中的GLY或Cys的位置70中的删除。SARS-COV-2 E序列也与同源蛋白质不同的位置55-56，其中Dyad Ser-PHE取代Thr-Val（蝙蝠冠状病毒分离物Btky72，加入码KY352407）。SARS-COV-2 E蛋白的变体在37和72的位置不同，其中他的替代物替换Leu和Leu分别取代保守的专业。表中报告了每个信封变体群集的大小1以及分离液的加入代码和定义。通过Modeller使用作为由PDB代码5X29鉴定的SARS-COV蛋白的五聚体离子通道结构的模板构建了E蛋白的同源模型。该序列与SARS-COV-2 E蛋白共享91％的同一性，并覆盖由8-65次占有1-65的段。数字2显示了sars - cov - 2e蛋白的同源模型结构，该蛋白组装为一个五聚体病毒孔蛋白样蛋白。数字2在三维模型上也显示不同位置。在短蛋白中，跨膜螺旋的预测是困难的。因此，跨膜拓扑不能可靠地分配。同样，实验也没有明确阐明E蛋白的哪些部分暴露在病毒膜的外部或内部[24.］．


变体	簇大小（序列的序列）	加入代码	定义

信封
YP_009724392(参考)	795

His37	1	MT03980	韩国/ SNU01/2020

Leu72	1	MT293206	美国/ WA-UW-1588/2020

膜
YP_009724393(参考)	773

Ser2.	1	MT291836	CHN / WUHAN_IME-BJ07 / 2020

GLY3.	1	MT325626	美国/ SC_3572 / 2020

Val57, Arg89	1	MT127115.	VIE / NIHE / 2020

		MT293184	美国/ WA-UW-1297/2020
lle70.	3.	MT326166	USA / WA-UW-1735/2020
		MT293211	USA / WA-UW-1591/2020

SER85.	1	MT326167	美国/ WA-UW-1753/2020

		MT326093.	USA / WA-UW-1775/2020
MET175	2	MT246451	美国/ WA-UW-194/2020

（一种）

（b）

图2.

来自SARS-COV-2的E蛋白的viroporin样Tellam组装的三维模型代表作为动画片模型。对应于图中所示的突变位点的残基1显示为透明空间填充球，并用氨基酸单字母代码标记。据报道了该模型的C末端段。然而，由于在同源模型中使用的结构模板中缺乏相应的段，它们不会传达结构信息。面板（b）中的结构沿着沿着约180°旋转关于面板（a）中所示的方向的轴。

3.3。膜糖蛋白

M糖蛋白在整个方面保守β-冠状病毒。然而，在收集的设定中鉴定了SARS-COV-2M蛋白的七种变体，而E蛋白仅观察到三种变体（图3.）。多序列对准显示SAR-COV-2M变体中具有显着的相似性（98％同一性）和来自蝙蝠和植物蛋白分离株的序列。但是，在n终端位置的差异（图3.可以观察到：在人SARS-COV-2的位置插入SER残基似乎是该蛋白质的独特特征。在相应的位置，RATG13 BAT M蛋白显示缺失，而BAT COVZXC21，CoVZC45和Pangolin MP789蛋白质具有ASP残余物。七种蛋白质变体在位置2,3,57,70,85,89和175处不同。表中报告了每个膜变异簇的尺寸1以及分离液的加入代码和定义。值得注意的是，来自SARS-COV-2 NIHE隔离物（加入代码MT127115）的蛋白质具有ARG，而不是在89（图中）处于保守的含量（图3.）。在预测的跨膜螺旋中发生突变，如果确认，可能对蛋白质特性产生显着影响（图3.）。

图3.

SARS-COV-2M蛋白变体中的多序列对齐和一组大多数相似的同源蛋白质。序列标签SARS-COV-2表示由REFSEQ代码YP_009724393标识的参考序列。红色框表示文本中讨论的n终端的变体网站。在多对准下的编号红色条标记跨膜螺旋的预测。连接环的位置相对于病毒杆表面表示为“In”或“Out”。布鲁背景表示保守的对齐位置。

M蛋白的三维模型取自I-Tasser服务器(代码QHD43419)，其他方法均未找到合适的模板。然而，需要指出的是，HHpred发现其与4N31的局部亲和力较弱，虽然低于统计学显著性水平酿脓链球菌对菌刺聚合是必不可少的。数字4.显示变体部位的位置到模型结构上。该模型已被AB Initio技术预测。因此，应该考虑很大谨慎，并且应该被视为实际结构的低分辨率近似。根据跨膜螺旋拓扑的预测，M蛋白的N-和C末端部分分别暴露在病毒颗粒外部和内部（图4.）。

4.讨论

以往的研究指出，E和M蛋白可能在病毒进入、复制和人类细胞内粒子组装中起重要作用[24.那25.］．根据可接受的理论，目前的Covid-19大流行是由A的跨物种传播引起的β-冠状病毒通常由蝙蝠或穿山甲传染给人类[3.那26.］．在本文中，从797 SARS-COV-2基因组中的e和M蛋白已与来自最密切相关的病毒的对应物进行比较，同时也评估氨基酸突变在Covid-19的外源性起源中的潜在作用。E蛋白是病毒膜的次要成分，但它被认为对病毒感染和复制的许多阶段都很重要[24.那25.］．序列比较表明，该蛋白与特定的蝙蝠和穿山甲冠状病毒分离物相同，尽管Sars- cov -2序列似乎与其他Sars冠状病毒具有特定的修饰和特征。特别是，Arg69是一种带正电的氨基酸，它取代了同源冠状病毒蛋白中分别带负电和中性的Glu或Gln残基。此外，在这个位置的两侧有一个Sars-CoV-2蛋白的特异性缺失。不幸的是，不可能可靠地预测这些修饰的位点是暴露在膜的内部还是外部。在任何情况下，取代和缺失出现了相当剧烈的变化，并可能对构象性质和蛋白质-蛋白质相互作用产生重大影响。还需要进一步的结构研究。然而，可以假设这些变化也会影响形成跨膜离子通道所需的低聚过程。

已经证明，M蛋白在病毒膜内更为普遍，认为它对于冠状病毒的萌芽过程是重要的。实际上，在病毒颗粒组件的过程中，该蛋白质与核衣壳，包膜，穗和膜糖蛋白本身相互作用[25.］．此外，在阿尔法冠状病毒中，已经证明该蛋白在细胞附着和进入过程中与刺突配合[27.］．因此，在暴露于病毒表面的N-末端区域中发生的突变可以在宿主细胞相互作用中发挥关键作用。

综上所述，本文的分析表明，E和M蛋白与穿山甲和蝙蝠冠状病毒分离株的结构相似。与此同时，比较突出了Sars-CoV-2蛋白的具体结构差异，这可能与跨物种传播和/或病毒特性相关。虽然还需要进一步的研究,很明显,这些氨基酸变化重要病毒进化的历史,和结果可能暗示类似突变冠状病毒家族会在下一年内其他家畜流行病流行事件类似,这些天我们正在经历。

数据可用性

所有的序列数据都可以在GenBank存储库中找到。完整的清单可在补充材料中找到。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作已由罗马萨皮萨大学的授予SP资助（RP11916B74B27C4D）。

补充材料

补充数据包括Excel文件，其中包含从Genbank检索并在物品中分析的797 SARS-COV-2基因组列表。对于每个基因组，序列头显示在Genbank中。标题在“>”字符后的每行的第一个字段中报告登录代码。（补充材料）

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