重建的系统发育Capsosiphon fulvescens(绿藻门，绿藻门)产于韩国加拿大皇家银行L和18S rDNA序列

摘要

Capsosiphon fulvescens是一种丝状绿藻，属于藻纲。它以其独特的风味和柔软的质地被作为食物用于治疗胃病和宿醉，其经济价值证明研究其营养和潜在的治疗效果是合理的。与这些应用相反，只有少数分类学研究进行了C. fulvescens.．特别是，分类和系统发育关系C. fulvescens.低于订单水平是有争议的。为了确定其在类群中的系统发育位置，我们使用加拿大皇家银行L和18S rDNA序列作为分子标记构建系统发育树。的放大加拿大皇家银行L和18S rDNA序列4C. fulvescens.分离株（Jindo，Jungheung，Wando和Koheung，韩国）用于通过采用三种不同的系统发育方法来用于系统发育分析：邻居连接（NJ），最大规定（MP）和最大似然（ML）。的加拿大皇家银行L系统发生树分析表明，Ulvales目各分类单元聚为一个单系群，确定了其系统发生位置C. fulvescens.属于乌洛特里克斯目。本研究的意义在于，18S rDNA系统发生树显示了详细的分类位置C. fulvescens.．在我们的结果中，C. fulvescens.被认为是狐尾藻科的一员，和尿孢子岛和Acrosiphonia．

1.介绍

Capsosiphon fulvescens(C. Agardh) Setchell和N. L. Gardner是一种丝状绿藻海藻，在北大西洋被发现[1，2以及北太平洋，包括朝鲜[3.]和日本[4］．它的自然栖息地是沿海沉积物和岩石海岸的潮间带上部，与常见的食用海藻共享石莼prolifera穆勒。Capsosiphon fulvescens，一种丝状绿色藻类，通过双鞭毛的同配子从两性配子体中释放出来进行繁殖[5］．众所周知，这种海藻是一种污染物Porphyra培养(6］．然而，在韩国西南部的省份，由于其独特的风味和柔软的质地，它被当作食物来治疗胃病和宿醉[7]及其经济价值证明其营养和潜在治疗效果。进行了几项生理学研究体外和在活的有机体内有建议吗C. fulvescens.对B16细胞黑素生成有抑制作用[8]，AGS胃癌细胞诱导细胞凋亡[9[过高胆固醇血清大鼠的胆固醇水平降低[10］．潜在的经济利益C. fulvescens.可以在实验室和田间进行大规模栽培[11］．

相反，关注其应用，只有几项分类学研究就会进行C. fulvescens.．特别是，分类和系统发育关系C. fulvescens.低于订单水平是有争议的。分类方案之间差异的原因包括形态特征的评价存在分歧。例如,C. fulvescens.生产配子和动物孢子等等丝藻属和尿孢子岛［12虽然它也被认为是密切相关的Monostroma由Migita [5这是由于在叶状体顶端附近有不连续的生殖斑块以及配子的相似性。然而,Chihara [4认为它与之密切相关Percuriaria和石莼因为叶子产生的受精卵直接发芽，而不形成厚壁的受精卵[4］．由于相似的性状可以从多毛目的收敛或平行进化中派生出来，因此很难识别同形性状。

随着PCR和测序方法的应用，海藻的分子系统学进展迅速。这种分子方法已经有效地解决了许多系统发育问题，而这些问题还没有利用表型性状来解决。核酮糖-二磷酸羧化酶大亚基基因(加拿大皇家银行L)和核基因组中的18S rDNA由于其较慢的同义核苷酸取代率和强的功能约束，已被广泛用于更高分类水平的系统发育关系推断加拿大皇家银行L序列降低了非同义替换的进化速率。第一个报告提到了分类C. fulvescens.由Hayden和Waaland介绍，从北大西洋与分子标记（CF.18s rdna）收集[13］．他们建议C. fulvescens.是Ulotrichales，这与永田的报告一致[12］．2008年，Hanic和Lindstrom [14]也用18S rDNA序列来证明C. fulvescens.和Pseudothrix北欧化工(实体以前称为C. groenlandicus.)不属于同一属Capsosiphon．

在这项研究中，第一次，C. fulvescens.已经被检验过加拿大皇家银行利用韩国不同省份新采集的材料的L基因和18S rDNA序列，对韩国人的系统发育地位进行了研究Capsosiphon fulvescens在溃疡症。

2.材料和方法

2．1．样品采集与培养

C. fulvescens.2011年12月至2012年2月，在韩国珍岛、光乡、万岛和长湖5个不同的海藻养殖场采集了藻体。它们在干净的冷水中被洗了几次，在被送回实验室之前一直保存在冰里。使用10个尼斯金瓶从不同的深度收集海水样本，尼斯金瓶排列在一个传导性、温度和深度(CTD)花环上。整个瓶子被重力过滤到47mm的Poretics膜过滤器(GE Osmonics, Fairfield, CT, USA)上，孔径为5μm，保存在密理博Swinnex过滤器支架(密理博，贝德福德，MA，美国)。过滤时间在30 min ~ 2 h之间;如果尼斯金瓶在2小时后没有完全过滤，则处理过滤器，记录过滤的海水量。新鲜采集的植物在8°C、30-50℃的玻璃培养容器中经海水过滤的培养基中生长μ摩尔光子米⁻² s⁻¹， 14: 10 h LD循环。这种藻类通过显微镜观察、人工从其他藻类中分离出来，并用自来水和蒸馏水清洗。正宗标准化合物购自东京Kasei Kogyo株式会社(日本)和Supelco公司(美国Bellefonte)。

2．2．DNA提取

全培养生物量Capsosiphon fulvescens采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取冻干材料的基因组DNA [15]，其中样品(~0.5 g)用无菌研钵和研杵在1ml CTAB中研磨。根据制造商的说明，使用Wizard PCR纯化系统(Promega, Madison, WI, USA)清洗DNA提取物。

2．3．PCR扩增及测序

18S rDNA的双链扩增加拿大皇家银行L区在50个区域内进行μL使用1.0μ总基因组DNA (10-20 ng)模板的L。PCR扩增1个单位TaqDNA聚合酶链反应缓冲液(Invitrogen)， 1.5 mM MgCl₂, 200年μM dNTP mix，和2.5μ每种引物的mol (PTC-200, MJ Research, Waltham, MA, USA)。的加拿大皇家银行L和18S rDNA基因的扩增使用已发表的引物和其他引物设计的对齐可用加拿大皇家银行l和18s序列（表1)，并符合下列条件。

首先在94°C变性3分钟，然后在94°C、50°C和72°C各进行35个循环，每个循环1分钟，然后在72°C最后延伸10分钟。PCR产物经1.2% (w/v)琼脂糖凝胶电泳分析，并用Wizard PCR纯化系统(Promega, Madison, WI, USA)纯化。使用ABI Prism BigDye终止循环测序准备反应试剂盒(Applied Biosystems Foster City, CA, USA)按照制造商的说明对清洗后的PCR产物进行测序。使用ABI PRISM 310基因分析仪(Applied Biosystems Foster City, CA, USA)的自动测序仪，从正向和反向两个方向生成序列http://dx.doi.org/10.1155/2016/1462916)．

2．4．系统发育分析

本研究中新创建的DNA序列的组件使用DNASTAR计划（DNASTAR，INC.，MADISON，WI，USA）进行。确定的序列的覆盖率为2倍。使用Clustalx 2.1执行多个序列对齐，默认参数并手动编辑。使用BLASTN搜索以鉴定的序列作为查询，从GenBank获得其他序列。二十五加拿大皇家银行利用Ulvophyceae的L序列构建系统发育树，有2条外群序列。用33个18S rdna构建系统发育树。系统发育分析采用Mega v6软件邻域连接(neighbor joining, NJ)和最大简约(maximum parsimony, MP)两种方法[18]完全删除差距。在MP分析中，在去除未表达性状后，核苷酸位置和特征状态变化同样加权。使用raxml v8进行m1分析[19]，以HKY模型的DNA序列进化和空白视为未知字符。对于所有3种分析类型，分支支持都通过引导(1000次重复)进行评估。

3.结果

3．1．宪法的加拿大皇家银行L系统发育树

C. Fulvescens RBC.L序列与之前发表的25个序列进行了比对加拿大皇家银行ulvophyceaceae纲Ulvales和Ulotrichales的L序列(图1)．

序列Myrmecia biatorellae和小球藻vulgaris.以木藻纲为外群(图1)．系统发育分析采用邻居连接(neighbor joining, NJ)、最大简约(maximum parsimony, MP)和最大似然(maximum likelihood, ML)三种方法。构建NJ树需要1253个核苷酸位置。基于MP准则的339个简约信息字符启发式搜索恢复了3个最简约的树(树长[]: 545，一致性指数[CI]: 0.454，保留指数[RI]: 0.645)。HKY DNA替代模型推断的ML树也恢复到3240.16得分。为了清晰，在ML树的节点上只显示了超过50%的MP和NP多数规则一致树。在支枝内，支枝包括Capsosiphon fulvescens和Protomonostroma undulatum被思考的姐妹被强烈支持Pseudothrix北欧化工和尿孢子岛登记入册。

3．2．18S rDNA系统发育树的组成

的C. fulvescens.18S rDNA序列与之前发表的33条绿藻序列对齐(图2）在去除所有间隙后，在1,439个核苷酸位置。

在33条序列中，13条序列代表超菊科(Ultrichales)中的赤藓科(ulotricaceae)、竹藓科(Gomontiaceae)、竹藓科(Gayraliaceae)和单层藓科(Monostromataceae)，其余序列代表石莼科(ulvellacaceae)、石莼科(Kornmanniaceae)、石莼科(Bolbocoleaceae)、棕藓科(Phaeophilaceae)和石莼科(ulvacaceae)。在18S rDNA分析中，Capsosiphon fulvescens发生在包含Acrosiphonia，尿孢子岛，Pseudothrix， 和protomonostroma.．它是密切相关的protomonostroma.强有力的支持。采用HKY DNA替代模型构建带有评分的ML树．

4.讨论

在海登和瓦兰之后[13]报告Ulvales和Ulotrichales sensu Floyd和O 'Kelly [20.]是单巧克里姐妹订单，ulvales中的系统学通过分子标记得到很好的支持，如18s rdna [21，22]，主要有3个科:石莼科、石楠科和石莼科。但其分类和系统发育关系比较复杂。尽管有一些研究表明C. fulvescens.要健康，就要地位C. fulvescens.在订单中，乌洛格里丽氏症仍然不清楚。系统发育树是在基础上构建的加拿大皇家银行L, 18S rDNA和组合序列。这些信息可进一步用于盐藻科和其他相关类群的系统发育分析和分类。

基于MATNAL的系统发育树加拿大皇家银行L和18S rDNA序列表现出拓扑差异，这是由于这些基因进化的不同速度。为了从我们的系统发生树中做任何陈述，我们的研究只选择了至少2棵不同系统发生树中>支持50%的树拓扑。的加拿大皇家银行L树(图1)恢复了Ulvales为一个单系群，这与前人的研究一致C. fulvescens.在Ulotrichales中支持度较弱，因为所有的系统发育树都显示出了相应的拓扑结构，且至少有50%的bootstrap值。

18S rDNA系统发育树(图2)，提供了更多的信息，以系统发育系统学和位置C. fulvescens.．Capsosiphon fulvescens在NJ和ML分析中出现在其自己的分支Ulotrichales;在MP分析中，它出现在ulotricaceae的基部。在所有的分析中，它显然属于Ulotrichales，因为将Ulotrichales与Ulvales的成员分开的对子分支有70%的bootstrap支持。

我们的系统发育树表明骨骼似乎是助理的。在ulotrichaceae中有两个明显不同的谱系（Acrosiphonia和尿孢子岛3种系统发育方法(ML/MP/NJ = 81/83/85)中，>的bootstrap数均为80%，这与SSU rDNA树一致[14，21］．这里的关键结果是，ulotricaceae的树状结构显示出4个不同的谱系:gloeotilopsis.，Acrosiphonia，Capsosiphon， 和尿孢子岛+protomonostroma.(图2)．这种树状拓扑[Acrosiphonia,(Capsosiphon，尿孢子岛+protomonostroma.)]在3种不同的系统发育树中，>的bootstrap支持率均为50%，表明Capsosiphon是更密切相关的吗尿孢子岛+protomonostroma.．利用18S rDNA数据集进行MP和NJ分析，恢复了3个支持良好的类群:(1)Gomontiaceae， (2) Monostromataceae， (3) ulotricaceae。无论在NJ树还是MP树中，紫萼藓科与其他属之间的关系都不是很好。NJ树的近外群ulotricaceae和Gomontiaceae + Monostromataceae与Kornmanniaceae的5个代表相似[22］．

系统发育分析结果表明，基于18S rDNA和加拿大皇家银行l序列分析解决了系统发育位置C. fulvescens.在丝藻目(数据1和2)．所有的4C. fulvescens.聚集了Urospora wormskioldii和Acrosiphonia arctaulotricaceae, Ulotrichales，在所有系统发育树中bootstrap数都很高(图2），建议Capsosiphon虽然需要额外信息来支持这一假设，是乌罗里援助的属性。我们将进一步研究该属的植物形态，以将其与UlotriChales中的已知属性的植物形态进行比较。

相互竞争的利益

作者们宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

杨承焕和钟桂华对这项工作贡献相同。

致谢

该项目得到了俄罗斯基础研究基金（15-04-02979）的支持。

补充材料

参考文献

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