MS2和PP7叠加显示TIA-1控件hnRNPA1

抽象性

FGFR2K-SAMexon反射由HnRNPA1绑定前端并用TIA-1绑定下游内核激活两种蛋白质都用细胞表达相似性,不管它们相交或互不相交,所以重要的是知道哪一个居主导地位回答这个问题时,我们使用细菌P7和细菌MS2大衣聚合系定hnRNPA1和TIAIhnRNPA1连接到一件大衣蛋白质后系K-SAMexon,内含相应的大衣蛋白绑定网站TIA-1连接到另一件大衣蛋白 系入下游内含大衣蛋白绑定网站高效K-SAMexlication测试结果显示TIA-1主控K-SAMexlication控件并验证PP7和MS2大衣蛋白合用学习后序事件

开工导 言

替代切片控制对正确基因表达至关重要,理解它如何工作很重要。我们一直在研究相互排外人FGFR2替代exonsK-SAM和BEK一号-4..K-SAM前科分解成膜细胞,BEK前科分解成膜细胞删除BEKexon并不导致高效K-SAMexlishmal细胞切除,删除K-SAMexon不导致高效BEKexli一号..两者均受至少部分独立的分片控制并辨识出主抗体和主抑制器TIA-1绑定一中子元素(IAS1)紧接K-SAMexon下游 复用网站激活ex5..下游2级和IAS3级下游2级分解增强器也与K-SAMexlication4..hnRNPA1绑定异样消音器抑制K-SAMexlication6..

TIA-1和hnRNPA1由上表细胞和中位细胞表示,因此可编译数种模型用于K-SAMexlication控件举例说,模型推理两种蛋白都绑定于米氏细胞中,HnRNPA1居主导地位:K-SAMexlicing受压模型中hnRNPA1不绑定膜细胞,K-SAMexon相切另一种可能的模型TIA-1和hnRNPA1都绑定在缩写细胞中网站,但TIA-1支配并激活K-SAMexlication第二模型TIA-1不绑定模数,但hnRNPA1绑定,K-SAMexlicing受压要区分这些类型模型,我们需要知道两种蛋白质中是否有一种占主导地位,如果有的话,哪一种占主导地位简单hnRNPA1或TIA-1超表达性研究无法令人满意地回答这个问题观察到的任何效果都可能是间接效果,包括由超表达式协议诱导合成的其他蛋白质绑定hnRNP A1连接Exon和TIA-1连接内核

先前我们用细菌MS2大衣核聚变系合hnRNPA16或TIA-17mRNA预分子装有RNA理发机并绑定MS2大衣将两种蛋白质绑定到同前mRNA分子意味着使用二联动式伴方,而二联动式伴方则不同RNA绑定特性服装蛋白伪可多那斯aeruginosaRNA细菌PP7绑定RNA理发机与MS2理发机相异8..结果,每件外衣蛋白都很好地联结到自己的发型上,但对于另一件外衣蛋白所识别的发型则显示微小相似性九九..PP7大衣聚变用法 将蛋白质绑定到转基因细胞RNAPP7叠加函数同MS2叠加函数相同,MS2和PP7叠加偏重同源绑定网站并显示TIA-1和HnRNPA1活动居主导地位

二叉素材方法

2.1.微型

RK97前文描述5..minigenes S3和S4用单P7或MS2RNA编码替换RK97中PstI-Xbai片段IAS2(293细胞中无可检测活动)和一些侧翼序列(Nucleotide80-214从K-SAM前on下游流出)1(b))微型S1和S2由RK12制版2BEKexon删除时用P7或MS2RNA编解码替换Ecori-EcoRVexon避免创建框架终止codon微型S5和S6分别取自S1和S2,代之以单片二或PP7RNA编码

2.2.聚合蛋白向量

MS2大衣序列pCI-MS26和PP7 FG大衣序列由纽约Robert Singer提供10s2开蓬或PP7序列编码 FG硬币使用标准技术dimer编码序列引入向量基于原pCI-neo(Promega)6sV40延迟多词信号底码序列下游从矢量序列编码FLAG附带标签分离SV40核定位信号TIA-1和hnRNPA1序列5,6分别用大衣角头制作矢量表示聚变蛋白SV40NLS在构造这些向量期间删除,因为TIA-1和hnRNPA1都有自己的NLS序列构造通过排序验证

2.3转接和RT-PCR

293-EBNA细胞(Invitrogen)由前文所描述的磷酸钙技术移植11共5 g模数脱氧核糖核酸:0.5 gminigene带0.02 gTIA-1-coat聚变向量和/或 ghnRNPA1-coat聚变矢量适当添加并用pEGFP-1 g脱氧核糖核酸条件选择经过初步实验测试的不同表达式向量/微量比并发微小元件并装点给聚变蛋白大衣和蛋白表达矢量,结果会显著改变复用量,但当微型元不包含绑点时不发生重大切换量hnRNPA1高量聚积蛋白表达矢量很可能是由于HnRNPA1是主要细胞RNA绑定蛋白hnRNPA1合成蛋白中只有小小片能用大衣粘合小型RNA,多分子用功能hnRNPA1模绑定手机RNARNA由RT-PCR使用immersP1和P2采集分析11..26-28周期放大保留指数放大范围产品按2%agarose gels迁移,转至Nylon滤波器^32码P标签链接C1和C2探针过滤器接受自放射学分析或用图量软件量化分析PhoshorImager445SI

3级结果与讨论

3.1.hnRNPA1和TIAIFT

原创TIA-1或hnRNPA1拷贝MS2和PP7大衣蛋白像角头卷绑定二拷贝系合只需要一份拷贝 将蛋白质叠成大衣稀薄编织两个大衣蛋白质并配短链路12..使用MS2与V75EA81G变异13PP7删除氨基酸67-75 FG)[10..我们为PP7制作表达式向量 FG或MS2大衣V75EA81G硬币加N-终结FLAG套接标签和SV40核定位信号1(a))矢量含有多链路插入FLAG标签和核定位信号之间的附加编码序列,并用于对hnRNPA1聚变(A1-PP和A1-MM)和TIA-1聚变(TIA-P和TIA-MM)做额外矢量编码hnRNPA1和TIA-1自有核定位信号后,SV40核定位信号序列编码从hnRNPA1和TIA-1聚变矢量中去除RNA预期绑定这些蛋白质的特性显示于图中1(b).西方布局取自293细胞FLAGM2抗体显示蛋白正确合成(数据未显示)。

3.2系式hnRNPA-PP7coat聚合压缩

我们的第一个目标是测试hnRNPA1和TIA-1编译PP7大衣复制我们已经描述的相应MS2编译行为6,7..为此,我们搭建各种FGFR2小型元件,内含基于K-SAM的不同前科和侧侧侧C1和C2前科和对应电流2)先前我们曾显示,用细菌反编码序列替代K-SAM内部exon序列(包括ESS)(变换以包括EcoRV和SalI网站),可提高K-SAMexlicing2))RK12EGRV-SALI碎片代之以包含K-SAMexonESS序列产生Exon3,4..RK12系统因此非常方便测试各种序列以测试其抑制K-SAMexcliminigenes S1和S2分别用P7或MS2理发机替换RK12ExonEcoRV-Sali碎片,允许A1-P或A1-MMminigenes为竞技BEKexon删除,因此使用minigene专用素P1和P2简单RT-PCR协议可用于测量K-SAM源码Exon

293细胞(通常不相交k-SAMexon)用S1或S2移植,RT-PCR使用素数P1和P2采集和分析RNA面向这些小型语言,CATexon像预期的那样高效复制,exon没有ESS3(a)车道1和5确定系合A1-P或A1-MM效果时,S1和S2与表达式矢量相交处理这些聚变蛋白S1CAT-PP7外延通过对A1-P矢量互译抑制(对道3对道1和2),其程度与S2CAT-MS2外延互译通过对线A1-MM矢量互译抑制(对道7对道5和6)。最重要的是S1CAT-PP7外延不通过对A1-MM向量互译抑制(对道4对道1和2),S2CAT-MS2外延不通过对道A1-PP向量互译抑制(对道8对道5和6)。这些结果显示,压制不能归结为hnRNPA1模范过分表达的间接效果,而需要hnRNPA1比前端绑定并发结果显示,每一种聚变都很好地偏向于同NNA理发机,hnRNPA1-PP7编译复制相应的MS2编译行为

3cm3系式TIA-1-PP7套装激活

测试系合TIA-PP可激活复制件和TIA-MM时使用微型元S3和S42)minigenes包含IAS1并携带k-SAMexon连接下游ientro中P7理发机或MS2理发机序列编码使用这些微型元而不是微型元的理由何在?后几微型元在这里没有用,因为TIA-1-coat聚变蛋白在招入取代IAS1理发机时不激活插件组合激活时,TIA-1紧接IAS1元件 复用网站需要联系UI snRNP 复用网站14..精确定位TIA-1RRM 复用网站对此联系人十分必要 。唯有TIA-1与IAS1交互才能定位,所以TIA-1连接到取代IAS1的理发机上不会激活分片然而,我们在别处显示,将TIA-1-MS2封装聚积到IAS1下游一原子点激活K-SAMExlication7..激活严格依赖IAS1,隐含绑定提高AIA-1局部集聚IAS1并允许绑定TIA-1绑定IAS1并因此与U1snRNP交互激活

293个细胞与S3或S4并发并分析RNAK-SAM前端没有高效分解3(b)第一道和第六道 内含功能ESS确定绑定TIA-P或TIA-MM效果时,S3和S4与表达式矢量相交处理这些聚变蛋白K-SAM前端连接异子PP7理发机S3通过迭代TIA-P矢量3编程1和2编程2启动K-SAM前端连通MS2编程S4编程2编程7编程8编程6和7编程

按实验中表达矢量计算,TIA-MM和TIA-PP仅略增K-SAMexon相联3(b)5街和10街我们不认为这反映了低级聚变对非coate发夹的绑定,而是低级绑定tIA-1mietiesIAS1因此,我们在别处显示,通过移植提高TIA-1浓度会诱导K-SAMexis5S3和S4K-SAM前缀连接IAS12)hnRNPA1编译结果(见上文)没有提供证据支持非coate发廊绑定

3.4.系定TIA-1系定hnRNP

系合式hnRNPA1抑制K-SAMexclihnRNPA1和TIAI同时绑定会怎么样minigenesS5和S6设计用于绑定hnRNPA1聚入CATexon和TIA-1聚入下游异子序列2)微元不包含ESSExon, 他们的CATexs高效分解到 293 单元格中4车道1和6A1-PP绑定S5CAT-PP7exon显著减少相联性(比对3道1和2道)。

绑定A1-PP几乎完全废除废除要求将TIA-MM绑定内核,因为TIA-MM并不会废除S1微型机实验中系定A1-P的复用压制,S1微型机内装有A1-PP,但不是TIA-MM绑定网站(lane5)。因此我们可以排除基于TIA-MM表达式的任何解释,

PP7和MS2理发机4??绑定MM或PP对CAT前例的影响一般微小(minigenes S1、S2和S5图象3(a)并4)MM连接S6CAT-MS2前导效果更大(从98%下降至58%,7道比6道)。无法解释不过,如果A1-MM系定值(从98%到13%比较8号道6和7号道7),相切减法大得多切需区分可归结为A1-MMM运动系取的部分(从98%减58%减13%)和可归结为A1运动系取的部分(从58%减13%)。串化A1-MM几乎完全消除,如果TIA-PP互译:串化水平从13%恢复到49%接近观察值58%单绑MM注意无法期望复位水平 恢复到98%绑定TIA-1没有理由消除A1-MM的压抑

A1模数系定A1-MM要求将TIA-P绑定内核,因为TIA-P互译并不会废除S2微型实验中的复用压定,S2微型实验中装有A1-MM,但不是TIA-P绑定网站(lane10)。因此我们可以排除基于TIA-MM表达式的任何解释,

4级结论

当TIA-1和HnRNPA1同时绑定并竞争K-SAMexclication时,TIA-1活动占主导地位通常TIA-1从exon次优下游绑定 复用网站帮助增用U1snRNP14..如果TIA-1居主导地位,则系合hnRNPA1不应抑制外延 复用网站通过变异实现最优化a1-PP不再抑制S1小型e 复数网站优化(数据未显示)我们建议K-SAMexlication模式TIA-1连接IAS1防止hnRNPA1抑制K-SAMexliK-SAMexon编译hnRNPA1与ESS绑定,但TIA-1与IAS1不绑定K-SAMexlication压缩TIA-1连接IAS1K-SAMexon除IAS1外还用两个直流分解增强器(IAS2a3)启动4..增强者可能录用蛋白质,通过绑定AIA-1接近IAS1至少部分工作,从而偏向IAS1绑定

最后,我们指出,将MS2大衣聚积或聚入细菌abdaN蛋白注入RNA分子的做法有利于研究后序事件,不仅包括串联性,也包括多语义化、翻译、RNA本地化和RNA稳定性15-23号..这些事件常隐含数个RNA绑定蛋白PP7和MS2聚合物合并使用方法因此应引起普遍兴趣,如果扩展至包括N蛋白聚合物,应允许将三种不同的蛋白质系入RNA分子

感知感知

作者感谢Robert Singer纽约分会提供装有PP7的金字塔 FG序列这项工作得到了Ligue抗癌委员会Atrictique和finistre支持。

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