分析核苷酸改变E6基因组地区的人类乳头瘤病毒类型6和11个尖锐湿疣样本来自巴西

文摘

湿疣acuminata (CA),或生殖器疣,良性增生性表皮或粘膜病变是由人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起的,主要是低风险类型6和11所示。人乳头状瘤病毒变种病毒序列被定义为共享的身份L1基因核苷酸序列的超过98%。根据这一标准,HPV6和11个研究了变异血统,还有正在试图将这些基因变异与不同的临床感染的结果。因此,本研究的目的是检测变异和核苷酸变化出现在人乳头状瘤病毒类型的E6地区6和11 CA样本中发现,关联人乳头状瘤病毒与clinical-pathological数据存在的患者,并确定系统发育关系变异从世界上其他地方。E6地区25 HPV6样本和7 HPV11样本CA放大使用与特定的引物PCR。克隆载体的产品的结扎和五个殖民地的每个样本测序观察核苷酸的改变。十二个样品被确认为HPV6B3变异,变异(鸟嘌呤)G474A(腺嘌呤),其中一个还显示突变T369G(胸腺嘧啶)。其他阳性13例HPV6B1没有核苷酸变化。HPV11样本的分析,所有的病人显示,突变T137C和C380T(胞嘧啶)。一个病人也提出了核苷酸改变T410C。 None of the mutations found in the 32 analyzed samples resulted in amino acid changes. Patient age, local occurrence, and HIV infection did not show significant association with HPV infection. Besides, the data found in this study did not show a relationship with the geographical region of isolation when compared to other data from different regions of the world. In this way, despite the nucleotide alterations found, it was not possible to observe amino acid changes and variants grouping according to geographical region.

1。介绍

湿疣acuminata (CA)、生殖器疣是良性增生性表皮或粘膜病变。古典CA早已公认的组织病理学特征和特点是棘皮症,乳头瘤样增生,角化过度,角化不全,koilocytosis [1]。这些病变,与乳头状瘤病毒(PV)感染,是观察到的动物,包括鲸类(2,3],猴子[4],和人类[5,6]。在人类中,CA是最常见的性传播疾病之一;有趣的是,性别偏见与人乳头瘤病毒11有关(HPV11)生殖器疣,即HPV11生殖器疣的比例是男性比女性高出三倍(7]。CA是由人类乳头瘤病毒(HPV)感染引起,主要是低风险类型6和11,尽管合并感染高危人乳头状瘤病毒类型也会发生(8- - - - - -10]。

乳头状瘤病毒是圆形的,一个二十面体组成的双链DNA病毒衣壳52-55 nm直径8 kb的基因组长度(11]。这些病毒分类的乳头瘤病毒科家族的特点是大量的遗传多样性(12,13]。目前有超过200人乳头状瘤病毒类型识别。病毒可以感染皮肤鳞状上皮或生殖器和口腔黏膜14- - - - - -16]。粘膜人类乳头瘤病毒是分类根据其致癌潜力:他们可能是高风险、16型和18型等,参与口腔、生殖器阴茎、肛门和颈癌(17- - - - - -21];或低风险,如类型6和11日,出现在生殖器和肛门疣和复发性呼吸道乳头瘤样增生(22]。

前研究评估遗传变异的控制区域(LCR)和E6地区使用标准参考基因组比较的目的(23- - - - - -25]。这些标准参考基因组HPV6和HPV6b被表示,nonprototypic HPV6a HPV6vc,和一个标准参考基因组HPV11。然而,研究基于系统分析的完整基因组来自出版HPV6和HPV11变异提出了一种新的标准命名HPV6和HPV1126]。两个深深独立演化支HPV6观察。的血统是由形成的参考基因组HPV6b和血统B HPV6a, HPV6vc, CAC301序列,对应HPV6B3, HPV6B2,和HPV6B1 sublineages,分别。HPV11血统的命名提出了基于两个演化支,称为sublineage A1,其中包括与HPV11引用变量聚类基因组和sublineage A2,其中包括所有其他变体。

攻击性差异人类乳头瘤病毒6和11个不同情况下相同的基因型可能与intratypical遗传学变异(27]。几项研究试图将这些基因改变与生物和生化特性,试图确定可能的差异clinical-pathological疾病的特点(28]。

Seedat等人发现重复的HPV6电感电容电阻测量,可能导致增强启动子活动。因此,可能会导致增加重复的致癌潜力HPV6变异归因于过度E6、E7 [29日]。

另一方面,Flores-Diaz等人没有遵守协会具体HPV11变异与临床疾病。这些可以解释为更高的保护HPV11 HPV6[相比30.]。

人乳头状瘤病毒多样性的分析是非常重要的未来的疫苗策略和评估疫苗成功在免疫力低下的个人31日]。

HPV感染可能与一些相关的风险因素,比如高的性伴侣数量,早期的年龄开始性行为,吸烟,怀孕,酒精,和以前的性传播疾病(性病)[32]。例如,烟草含有尼古丁,香烟烟雾的主要免疫抑制成分,对全身和局部免疫力有有害的影响,抑制免疫反应和增加对HPV感染的易感性和持久性,导致HPV-associated病变的发展(33,34]。免疫反应有一个重要的角色在消除许多人乳头状瘤病毒感染。然而,一些感染不能消除和持续多年,这是一个额外的癌症发展的风险因素(35]。个人‎感染人类免疫缺陷病毒(HIV)更容易感染人乳头状瘤病毒。缺乏免疫细胞由于艾滋病毒感染导致免疫系统的不稳定,应该打击高和低风险的人类乳头瘤病毒,促进病毒持久性和病变进展(36- - - - - -38]。

因此,我们的目标是评估E6早期基因变异性HPV6和HPV11 CA中发现从一群巴西获得患者的样本和相关的临床病理资料。我们还进行了系统发育分析比较核苷酸序列中确定我们的研究与先前描述隔离从世界的其他地方。

2。材料和方法

2.1。临床样本

伦理研究伦理委员会的许可获得生物科学研究所的信件和确切的圣保罗州立大学的科学,在圣荷西市的里约热内卢Preto,车牌号码1.529.236。

本研究评估25阳性样本HPV6和7 HPV11阳性样品。32个样本孤立从手术活检获得的部分从女性生殖器和肛周病变患者参加临床医院圣保罗大学的医学院的小溪Preto。患者年龄介于16至78岁,平均年龄为26年。当地发生病变的百分比分析患者肛周的生殖器区域的50%和34.4%;15.6%的样本显示(表的任何信息1)。

2.2。人乳头瘤病毒基因分型

这些样本的DNA提取使用苯酚氯仿的协议(39),DNA完整性评估通过β球蛋白基因扩增,产生315 bp的扩增子(40]。放大了人类乳头状瘤病毒DNA存在于这些病变,我们用聚合酶链反应(PCR)针对HPV L1的地区。反应在两个放大处理步骤:在第一反应,PGMy09 PGMy11寡核苷酸(补充表1)被用来生成一个450 - bp扩增子。放大组合由2.5 U的Taq DNA聚合酶(美国佛罗里达州Sinapse Inc .), 2.5μl 10 x PCR缓冲,5.6μM MgCl₂核苷酸,0.2毫米,0.4μ每个引物,500 ng的DNA,和核酸酶游离水,所有这一切加起来25.0最后一卷μl。最初的变性步骤在95°C进行了9分钟,其次是40周期在95°C 1分钟,1分钟55°C,和72°C 2分钟和最后一个扩展5分钟。72°C的嵌套PCR, GP5 + (5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3′)和GP6 + (5′-CTTATACTAAATGTCAAATAAAAA-3′)寡核苷酸是用于生成150 - bp放大产品。放大组合由2.5 U的Taq DNA聚合酶(美国佛罗里达州Sinapse Inc .), 2.5μl 10 x PCR缓冲,7.6μM氯化镁(MgCl₂₎0.48,0.064毫米deoxynucleotides(核苷酸),μ每个引物的米,5.0μl的产品从PGMy09 PGMy11反应,和核酸酶游离水,所有这一切加起来25.0最后一卷μl。最初的变性步骤在95°C进行了9分钟,其次是40周期在94°C 30秒,45°C 30秒和72°C 30秒,和最后一个在72°C扩展8分钟。净化产品通过桑格法使用引物测序PGMy09/11和GP5 + 6 / +41]。

2.3。E6放大和克隆

对于核苷酸变异分析,完整的HPV6和HPV11-positive E6基因序列样本放大使用与特定的引物PCR (HPV6: F: 5′GGGGGATCCGAATTCATGGAAAGTGCAAATGC 3′和R: 5′GGAAGACATGTTACCCTAGGATCCAAGCTTCAC 3′;HPV11: F: 5′AAAATTAGCAGACGAGGCATT 3′和R: 5′AGATGAGGTGGACAAGGTGG 3′) (42]。校对的放大组合由6.0 U聚合酶(高保真酶混合,Fermentas维尔纽斯,立陶宛),5.0μl 10 x高保真PCR缓冲,1.5毫米MgCl₂核苷酸,0.24毫米,0.4μ每个引物,500 ng的DNA,和核酸酶游离水,所有这一切加起来50.0最后一卷μl。最初的变性步骤在95°C 5分钟,其次是35周期在95°C 1分钟,1分钟55°C, 72°C 2分钟和最后一个扩展为8分钟72°C。HPV6 E6的放大产品467个基点和569个基点HPV11 E6。

获得更可靠的测序数据,放大E6地区从每个病人结扎pJET1.2 /钝的克隆载体克隆喷气PCR克隆工具(美国马萨诸塞州热科学)后,制造商的指示。克隆的产品转换(43到化学DH5主管αZ大肠杆菌(美国加州Zymo研究)通过热冲击的方法。转换后,细菌传播到佩特里板块包含固体Luria-Bertani(磅)介质和0.1毫克/毫升的氨苄青霉素。样本在37°C孵化16个小时。随后,五个殖民地中每个样本选择和孵化的液体LB培养基为0.1毫克/毫升的氨苄青霉素在37°C 16小时和震动250 rpm。细菌生长后,质粒DNA提取使用GeneJET™质粒Miniprep工具包(Fermentas维尔纽斯,立陶宛)后,制造商的指示。

2.4。核苷酸变化检测

纯化产品通过桑格测序方法使用克隆载体引物(pJET1.2向前测序引物:5′CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 3′和pJET1.2反向测序引物:5′CTGCCATGGAAAATCGATGTTCTT 3′)。

2.5。数据集和序列分析

序列质量评估使用Electropherogram质量分析程序,网上在<http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/>。比较所获得的序列,并且那些先前添加到基因库进行使用爆炸(基本的局部比对搜索工具,可以在<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST>)。

所有序列都是编辑使用BioEdit 7.0.9.0包删除向量碎片和分析仅仅E6的完整序列的基因。原型序列之间的对齐HPV6A(加入数字:X00203) nonprototype序列HPV6B1(加入数字:AF092932) HPV6B2(加入数字:FM875941)和HPV6B3(加入数字:L41216) HPV11A1参考序列(加入数字:M14119)和HPV11A2(加入数字:FN870447),和这一研究获得的序列使用CLUSTAL W软件执行嵌套在BioEdit 7.0.9.0包(44,45]。

生成的序列在本研究中被提交给基因库;补充表中加入数字列出2。

执行系统发育分析,数据集被组装,包括核苷酸序列生成在这项研究中,参考序列,和其他序列可以在基因库对于每个人乳头状瘤病毒类型。HPV6和HPV11数据集包括184年和101年的核苷酸序列,分别与453年残留。所有的序列的基因库加入数字补充表中给出3。

2.6。系统发育分析

系统发育树重建的最大似然方法使用PhyML程序通过ATGC平台从法国南部的生物信息学实验室(http://www.atgc-montpellier.fr/phyml/) (46]。替换模型计算两人乳头状瘤病毒类型(6 - 11)使用jModel测试软件(47]。引导1000复制用于计算分支的支持。值超过70%被认为是重要的。

2.7。统计分析

克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来确定如果有重大关联人乳头状瘤病毒和HIV病毒载量和人乳头状瘤病毒之间存在和病人的年龄。HIV病毒载量的样品是由支链DNA试验(熟练的艾滋病毒RNA测试,版本3.0,量化50拷贝/毫升的下限;西门子医疗、德国埃朗根)和值高于50 hiv - 1 RNA拷贝/毫升被认为是hiv阳性。p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

皮尔逊卡方、似然比卡方和费舍尔的确切测试是用来确认协会人乳头状瘤病毒感染的危险因素(艾滋病毒的存在)。这些测试也用于分析核苷酸变化之间的关系和病变的解剖位置。p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。临床特点

对于年龄因素,61.3%的患者16 - 29岁之间,和38.7%的30多岁。然而,无论是病人年龄还是当地发生HPV6和HPV11存在显著相关。相关风险因素,21.9%的患者的艾滋病毒检测,统计分析并没有显示出显著的人乳头状瘤病毒和人乳头状瘤病毒合并感染之间的联系。是不可能执行统计分析HPV感染,饮酒,吸烟,因为丢失的患者数据。

3.2。核苷酸变化检测

3.2.1之上。HPV6

25 HPV6样本序列分析后,指出它是12(48%)样品属于HPV6B3 (L42216)变体和所有这些样本将G474A突变相比原型E6序列。此外,样本BR_CA06_B3显示一个核苷酸改变在基因组的位置369,从T G(表组成的变化2)。其他13(52%)属于HPV6B1 HPV6样本(AF092932)变体,没有显示额外的核苷酸的改变。

Modeltest进行确定最佳替代模型系统发育重建。HPV6数据集替换模型选择是Tamura-Nei + I + G (TrN + I + G)。最大似然系统发育树重建使用PhyML基于所选模型引导1000复制。

获得的系统发育树的分析分为两个主要分支,分支强劲的支持(图1)。92年的一个分支,引导分组HPV6A原型序列与隔离与此相关的变体。另一分支,也引导92,分组所有HPV6B变体,并分为两个二级分支。一个二级分支包括HPV6B3序列,从这项研究包括12个序列与参考序列。第二个分支包括HPV6B1 HPV6B2 sublineages。从这项研究13个序列分组在一个单元分支,没有分支机构的支持,HPV6B1 sublineage参考序列和相关文献中出现的序列。因此,序列不组根据地理区域或感染的解剖部位。

3.2.2。HPV11

七HPV11样本分析显示,所有样本属于HPV11A2变体只是示例BR_CA28_A2核苷酸改变T410C(表3)相比,序列LP19(加入数字:FN870447)列为HPV11A2伯克et al ., 201126]。所有的32个样本分析突变导致氨基酸的变化。

Modeltest被用来确定最佳替代模型系统发育重建和HKY模型被选中。最大似然系统发育树重建使用PhyML基于所选模型引导1000复制。

系统发育树隔离成两个主要分支。其中之一,86年的引导,包含HPV11A1原型序列(M14119) LZod45变体,隔离来自其他研究(图2)。第二个分支分组HPV11A2序列从这项研究和巴西,斯洛文尼亚,澳大利亚的隔离。因此,它是观察到的序列不组根据他们孤立的地理区域或解剖部位的检测。

4所示。讨论

HPV11 E6、E7蛋白扮演重要角色在确保生产病毒生命周期,促进游离病毒基因组的维护(48]。这些区域的突变可能导致病毒的感染潜在的差异(31日),可能是由于不同的病毒与宿主细胞的相互作用机制,调节其临床过程(31日]。

在这项研究中,12 CA样本属于HPV6B3变体,它们有一个核苷酸改变474人乳头状瘤病毒基因组的位置。这种突变被发现在澳大利亚肛门与生殖器的样品(49)和巴西复发性呼吸道乳头瘤病样本(42]。相比之下,在病毒基因组核苷酸改变在369的位置观察到在我们的研究中没有观察到在这两项研究。尽管核苷酸替换在E6序列,发现氨基酸变化在我们的研究中没有观察到。虽然变异之间的差异小,HPV6B1变体是稍微更频繁的在这个研究。这些数据证实HPV6B1的报告是最常见的变体在复发性呼吸道乳头瘤样增生和生殖器疣23,42,49]。这变种是高度保守的生殖器病变分析在这项研究中,因为它没有任何核苷酸改变。一个CA的研究样本HPV11-positive显示变更与HPV11A2序列(加入数字:FN FN870447)。核苷酸改变病毒基因组的位置410被发现在复发性呼吸道乳头瘤样增生(42]。然而,这种改变并不导致氨基酸的变化。HPV11变体的存在而不是原型序列也被观察到在其他研究23,42]。不同sublineages相同的HPV基因型可能导致改变病毒感染持久性和前体病变的发展,还可能影响病毒组装、免疫应答、致病性、p53退化(50]。

在系统发育分析,它是不可能观察到基因变体分布根据地理区域的病毒是孤立的,当观察到人类乳头瘤病毒16和18。这两种类型的人乳头状瘤病毒的起源和在非洲进化然后传播多元化通过人类的迁移。因此,变异在几个不同地理位置(51,52]。与基因型16和18,先前的研究,这项研究表明,基因组多样性HPV6和11个孤立从几个解剖网站不相关的地方样本是孤立的23,42,48,53]。我们建议没有病变的解剖部位之间的联系和HPV6 HPV11变体。与这个不同的是,Jelen et al。54观察到一个协会sublineages B1和B3肛门-生殖器感染。肛门-生殖器病变之间的关系和sublineage B1也发现了Danielewski et al。49]。

还需要更多的研究来分析HPV intratypic基因变异的影响增加致癌的风险发展(55]。数据中观察到目前的研究和文献中表明,变异类型和乳头瘤病毒识别和风险因素的相关性可能是有用的病变风险分析和管理的策略。

人类乳头瘤病毒感染的危险因素可能包括生殖器接触,早期的性行为,一生的性伴侣数量,以前的性传播疾病,吸烟,饮酒34]。逃税人乳头状瘤病毒的免疫反应是至关重要的对于一个成功的感染(35]。女性感染HIV风险较高便于HPV持久性和减少能力控制致癌病毒的过程(56]。然而,在目前的研究中我们没有观察到显著的人乳头状瘤病毒和艾滋病毒合并感染研究协会在非洲与男性于是低风险的人乳头状瘤病毒与艾滋病发病率无关(57]。对于年龄因素,61.3%的病人是16 - 29岁之间;其他患者超过30岁。下发生在老年妇女人乳头状瘤病毒感染可能是由于消除和自然免疫力。然而,这也可以减少相关的老年妇女中增加安全的性行为(58]。这个研究显示之间没有联系的统计分析HPV持久性和病人的年龄,因此,颈也观察到样品(59]。

5。结论

在目前的研究中,可以观察到12 HPV6B3变异,所有这些G474A突变。一个HPV6B3示例还显示T369G突变。其他HPV6样本确定为核苷酸改变HPV6B1变体,没有礼物。T410C变更被发现在一个HPV11样本。系统发育分析显示之间没有联系的地理或解剖部位HPV检测和HPV6 HPV11变体。

缩写

旅客:	鸟嘌呤
答:	腺嘌呤
师:	胸腺嘧啶
C:	胞嘧啶
CA:	湿疣acuminata
人乳头状瘤病毒:	人类乳头状瘤病毒
艾滋病毒:	人类免疫缺陷病毒
PV:	乳头瘤病毒
STD:	性传播疾病
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
MgCl2:	氯化镁
核苷酸:	Deoxynucleotide
磅:	Luria-Bertani
爆炸:	基本的局部比对搜索工具。

数据可用性

“序列”数据,支持本研究的发现与加入代码存入基因库“MF375424”、“MF375425”、“MF375426”,“MF375427”、“MF375428”,“MF375429”、“MF375430”,“MF375431”、“MF375432”,“MF375433”、“MF375434”,“MF375435”、“MF375436”,“MF375437”、“MF375438”,“MF375439”、“MF375440”,“MF375441”、“MF375442”,“MF375443”、“MF375444”,“MF375445”、“MF375446”,“MF375447”、“MF375448”,“MF375449”、“MF375450”,“MF375451”、“MF375452”,“MF375453”、“MF375454”,“MF375455”。

伦理批准

所有程序中执行研究涉及人类受试者按照道德标准机构和/或国家研究委员会1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案或类似的道德标准。

同意

知情同意是获得所有个体参与者包括在这项研究中。

信息披露

所有作者同意出版。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持Fundacao德帕罗尽管Estado de圣保罗(FAPESP,必须占州政府批准号2015/06628-7)。

补充材料

补充1。表1:寡核苷酸序列组成PGMy09 PGMy11。

补充2。表2:序列生成的研究及其加入数字基因库。

补充3。表3:HPV6和HPV11序列可以在基因库用于系统发育分析(42,49,60- - - - - -67年]。

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