茶多糖(TPS)通过调控miR-375/SRXN1轴减少氧葡萄糖剥夺/复氧诱导的星形胶质细胞凋亡

摘要

客观的．研究miR-375/SRXN1轴介导的茶多糖(TPS)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)小鼠脑缺血-再灌注损伤及星形胶质细胞增殖和凋亡的影响。方法．建立小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型和OGD/ r致AS损伤模型;TTC染色法测定脑阻塞体积;用干/湿重量比测量脑含水量;过氧化氢(H₂O₂)， H₂O₂试验设备;MTT法和流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡率;采用qPCR检测OGD/R-AS中miR-375的表达水平;采用双荧光素酶报告基因法验证miR-375与SRXN1的靶向关系;qPCR检测miR-375、SRXN1、Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA水平;Western blot检测SRXN1、Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白水平。结果．脑梗塞的体积，脑含水量和H.₂O₂随着TPS浓度的增加，小鼠血清中TPS含量逐渐降低。体外TPS处理可有效提高OGD/R-AS活力，降低凋亡率;过表达miR-375可抑制AS活性，但增加AS凋亡率;TPS处理可降低OGD/R-AS中miR-375的表达;MiR-375在AS中靶向SRXN1;抑制miR-375表达显著上调SRXN1水平;同时过表达SRXN1的TPS处理可显著提高OGD/R-AS活性，减少细胞凋亡;而同时过表达SRXN1和miR-375的TPS处理与对照组相比，细胞存活率和凋亡率无显著差异。结论．TPS通过调控miR-375/SRXN1分子轴，减轻小鼠脑缺血-再灌注所致星形胶质细胞损伤。

1.介绍

缺血性中风，脑血流量中断的主要原因之一，也是全世界死亡和残疾的重要因素[1］．缺血性中风后恢复大脑血液供应可能导致再灌注损伤[2］．再灌注刺激活性氧(ROS)的过量产生，如过氧化氢(H2O2)，从而诱导细胞增殖、生长停滞，并导致细胞凋亡和坏死[3.］．星形胶质细胞(AS)是中枢神经系统(CNS)中主要的胶质细胞类型之一，具有调节血脑屏障通透性、胶质瘢痕形成和突触活动等多种功能[4］．越来越多的证据表明，缺血再灌注后神经细胞凋亡和死亡是加重脑损伤的主要原因[5］．因此，研究新的脑缺血-再灌注治疗策略迫在眉睫。Sulfiredoxin-1 (SRXN1)是一种内源性抗氧化蛋白[6在神经保护中起着重要作用[7］．SRXN1可抵抗细胞氧化应激诱导的ROS生成[8，9］．Zhou et al. [10]报道了SRXN1在保护大鼠皮层AS细胞凋亡中的抗氧化作用，证实SRXN1是治疗脑缺血-再灌注损伤的潜在靶基因。

茶多糖(TPS)是从茶树的叶子、花和种子皮中提取的杂多糖[11主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖葡聚糖、果胶和蛋白质组成。近几十年来，TPS及其相关茶制品的化学和生物活性研究取得了显著进展。TPS对健康有很多好处。它具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤作用，以及减少中风后脑缺血-再灌注损伤的能力[12]，以改善糖尿病[13]，提高身体免疫力[14，以减少肝毒性[15］．然而，其在大多数疾病中其作用的分子机制是未知的。

MicroRNAs (miRNAs)是一种新发现的内源性非编码rna，通过结合3中的靶位点参与转录后基因调控 -靶mRNA的UTR，并导致mRNA降解或翻译抑制[16］．在动物研究中，研究者分析了脑缺血再灌注后的miRNA型材，发现在缺血再灌注12小时内检测到高miR-375表达，而其他上调基因的表达逐渐达到72小时后逐渐达到峰值。因此，预期miR-375是脑缺血再灌注的诊断和治疗靶标[17］．据报道，MIRNA被外部因素刺激以改变其表达，从而具体调节靶基因的表达。有一些报道通过调节miRNA的表达，多糖在体外发挥抗炎和抗氧化作用[18，19］．然而，目前还没有关于多糖通过miRNA调控AS活性和减轻脑缺血再灌注损伤的报道。

因此，在这项研究中，我们通过建立宏小鼠模型和OGD / R和损伤模型来研究TPS对缺血再灌注损伤后的保护作用，并试图为TPS减少氧化而提供新的见解压力引起的细胞凋亡。我们的研究结果表明，TPS可以通过调节miR-375 / srxn1轴来缓解脑缺血再灌注和减少星形胶质细胞凋亡，为多糖对治疗脑缺血再灌注损伤的影响提供了新的潜在理论依据。

2。材料和方法

２.１.材料

2.1.1。动物源

重量为25-30克的54名男性ICR小鼠从Kay Biological Technology（上海）有限公司（上海）有限公司购买，Ltd。在恒温室中占12小时光/ 12小时暗循环，每日饲料和水经常提供。

2.1.2。细胞起源与培养

星形胶质细胞（AS）购自上海宇博生物科技有限公司（物品编号：HUM-YB-N012）。如在37℃和5％Co的完全培养基（DMEM / FBS）中依赖于含有12％牛血清的培养物₂．然后将细胞培养至对数相进行后续实验。

2.1.3。主要试剂

99%活性成分(鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖葡聚糖、果胶、蛋白质)TPS购自南京通营生物科技有限公司。胎牛血清、全培养基、LipofectamineTM 2000试剂均购自Invitrogen公司。Trizol和RNA提取试剂盒购自北京天健生物科技有限公司。SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒、PrimescripTM RT试剂试剂盒、miRNA PrimescripTM RT试剂试剂盒购自Takara公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。H₂O₂内容包购自北京朝阳生物科技有限公司双荧光素酶报告基因试剂盒购于北京佰奥莱博有限公司。蛋白提取试剂盒购自南京科根生物科技有限公司。Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒购于上海宇博生物科技有限公司。

２.２.方法

2.2.1。MCAO小鼠建模和TPS治疗

打开水合氯醛麻醉小鼠头肌，清洁颅骨表面筋膜，将激光多普勒流量计探头固定在颅骨特定位置。卧位皮肤中间切开，分离组织。暴露右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，用6-0丝线缝合结扎。用微电凝血器分离颈外动脉，在颈总动脉分叉处做一个小切口。在颈外动脉的切口处插入一条纤维并用另一条丝线缝合。松开结扎的颈内动脉，沿着颈内动脉缓慢插入颅内，深度约9毫米。60min后，拔出细丝，结扎颈外动脉切口。松开颈总动脉的结扎，缝合皮肤。完全清醒的老鼠被送回笼子。假手术组小鼠除使用灯丝外，其余与手术组小鼠相同。 Mice in TPS treated groups were given intraperitoneal injection of TPS (0, 50, 100, 150, and 200 mg kg^－1)，再灌注损伤72 h后每12 h进行一次。假手术组和模型组每次注射等量的生理盐水。

2.2.2。小鼠脑梗死体积的检测

脑缺血再灌注72 h后取小鼠头部，−20℃冷冻30 min。将2.0 mm连续切片的脑组织放入1% TTC磷酸盐缓冲液中，37℃水浴30分钟。然后对切片进行扫描，用Image pro plus 5.1软件计算脑梗死体积占脑总体积的百分比。实验重复了3次。

2.2.3。脑含水量的测定

脑缺血再灌注72 h后取小鼠头部。获得了大脑，并记录了湿重。然后将大脑放入110-115°C的烤箱中烘干至恒重，以确定干重。脑含水量计算公式如下: ．进行了三次重复。

2.2.4。H₂O₂分析

H₂O₂在415 nm处用H₂O₂内容包和微版阅读器。

2.2.5。建立OGD / R模型

利用OGD/R治疗模拟体外缺血-再灌注损伤[20.］．简单地说，将原来的DMEM培养基替换为无糖DMEM进一步进行AS培养。细胞在含5% CO的缺氧环境中孵育6小时₂, 1%的人啊₂， 94%₂．然后将AS转移到正常DMEM培养基中，再孵育24 h。

2.2.6款。细胞增殖检测

将从培养基中刮取的AS置于无血清溶液中，吹入单个细胞中，悬浮培养。然后将细胞接种到96孔板上，密度为每孔5000个，每孔20个μ分别加入0、10、20、40、60 mg/L的TPS。然后是10的解μ加入溶解在PBS中的L MTT，在37℃5% CO中孵育细胞₂为4 - 6 h。取出培养孔中的培养液，150μ加入L的DMSO。10分钟后，在570 nm处用酶标仪检测吸光度值。进行了三次重复。

2.2.7。细胞凋亡检测

各组细胞处理48 h, 600 × g离心5 min，弃上清，PBS洗涤1次。每组细胞按密度播种于6孔板中 并培养12小时。使用膜蛋白V-PE / 7-AAD凋亡试剂盒和流式细胞仪（美国BD Biosciences）检测不同治疗的细胞凋亡。

2.2.8。实时荧光定量(qPCR)

用TRIzol和RNA提取试剂盒提取MA总RNA。用NanoDrop测定RNA质量和浓度，并均匀稀释至500 ngμl^－1．利用PrimeScript RT和miRNA PrimeScriptTM RT试剂盒将RNA逆转录为cDNA，引物由生工生物技术(上海，中国)合成。以SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒为模板进行qPCR扩增。使用LightCycler®96仪器(瑞士罗氏):在95°C初始变性30秒，在95°C变性5秒，然后在60°C退火/拉伸30秒，共40个循环。以GAPDH和U6作为mRNA和miRNA的内参考，用2计算mRNA的相对表达量^-ΔΔCT.方法。荧光定量PCR所用引物序列如表所示1．进行了三次重复。

2.2.9。Western Blotting.

用RIPA从细胞中分离蛋白质。将相同浓度的蛋白混合物(含上料缓冲液)在95℃下煮沸10分钟。然后,20μL混合物(含30-50μ将G样品中的克样品加入10％聚丙烯酰胺凝胶的板中，并进行电泳以分离蛋白质。将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜，封闭，然后用一抗抗体在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤样品，并在室温下与二抗孵育1小时。β以-Actin为内参，用Image j确定灰度。三次重复。

2.2.10。细胞转染

取对数生长期的细胞，制备细胞悬液。的 细胞接种在6孔板中，在37°C和5% CO下培养₂24 h。Lipofectamine 2000:将DNA复合物轻轻混合，然后静置。室温孵育20 min后，加入细胞培养液上清混匀，再培养24 h。RT-PCR和Western blotting检测miRNA或mRNA的转染效率。进行了三次重复。

. 2.2.11。Dual-Luciferase记者分析

将对数生长期的细胞置于96孔板中培养，取融合度为80%的细胞转染，再培养48 h。100年μ每孔加入L的裂解液，12000 rpm离心5 min。上层清液(50μL)转移到96孔板，然后40孔板μ每孔加入荧光素酶测定底物L，轻轻摇匀10 s，检测荧光强度。一个额外的40μ将Renilla荧光素酶测定底物的L加入96孔板，轻轻混合10 s，使用Glomax光度计(Promega, USA)测定荧光素酶活性。进行了三次重复。

2.3。统计分析

采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析和统计图表绘制。组间数据差异使用Student 's进行统计分析 -检验及单因素方差分析。 被认为是统计学意义的， 非常重要, 非常重要。

结果

３.１.TPS可改善脑缺血再灌注损伤

脑梗死区(图1(一))和脑含水量(图1 (b))，与不给药组比较，各给药组大鼠脑缺血再灌注损伤随TPS浓度的升高而逐渐降低。H₂O₂测量脑组织中TPS含量，发现在脑缺血-再灌注损伤脑组织中，随着TPS浓度的增加，TPS含量逐渐降低(图)1 (c))．

３．２．TPS可降低OGD/R-AS细胞凋亡

采用MTT法检测OGD/R处理下TPS对AS细胞增殖的影响，结果显示，随着TPS浓度的增加，AS细胞活力逐渐增强，在40mg L时细胞活力最高⁻¹治疗(图2(一个))．因此，0和40毫克L⁻¹在随后的实验中使用了TPS。流式细胞术检测各组AS细胞凋亡情况¹)处理后，AS细胞凋亡水平较对照组明显下降(图)2（b）)．同时，qPCR和Western blotting结果显示，抑制凋亡的Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均升高，而促进凋亡的Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表达水平均受到抑制(图)2（c）和2（d）)．

3.3。TPS通过抑制miR-375的表达降低了OGD/R-AS的凋亡

检测不同浓度TPS处理下AS中miR-375的表达，结果显示，随着TPS浓度的增加，miR-375的表达呈下降趋势(图)3（a）)．为了进一步研究miR-375在OGD/ r诱导的AS凋亡中的作用，构建miR-375模拟载体转染OGD/ r诱导的AS。QPCR检测了miR-375在AS中的表达，我们发现与对照组相比，miR-375模拟物转染增加了miR-375在AS中的表达(图)3（b）)．MTT法检测细胞增殖，结果显示过表达miR-375抑制细胞增殖，而过表达miR-375与TPS处理的共同作用部分抑制细胞增殖(图)3（c）)．与AS增殖相反，过表达miR-375增加了凋亡率，而过表达miR-375和TPS处理可部分缓解凋亡(图)3 (d))．qPCR和Western blotting结果显示凋亡相关的Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白水平与细胞凋亡一致(图)3 (e)和3 (f))．

3．4．mir - 375 SRXN1目标

首先通过生物信息学工具（Starbase）预测MiR-375和SRXN1靶结合位点（图4（a）)．此外，miR-375和SRXN1之间的相互作用通过双荧光素酶报告基因检测得到验证4 (b)结果显示，与miR-375 NC+SRXN1-WT转染的细胞相比，转染miR-375 mimic +SRXN1-WT的细胞荧光素酶活性显著降低。转染SRXN1-MUT对荧光素酶活性无显著影响。qPCR和Western blotting结果显示，转染miR-375 inhibitor的细胞中SRXN1 mRNA和蛋白表达水平升高(图)4 (c)和4 (d))．

3．5．miR-375/SRXN1轴介导的TPS可减少OGD/ r诱导的AS损伤

首先，采用qPCR和Western blotting检测转染效率以及过表达miR-375对as中SRXN1表达的影响。研究发现，过表达SRXN1可增加OGD/ r处理的AS中SRXN1的mRNA水平和蛋白水平，而miR-375过表达可抑制SRXN1的mRNA和蛋白水平。此外，过表达SRXN1和miR-375可以恢复被抑制的SRXN1表达(图)5(一个)和5 (b))．随后，检测miR-375/SRXN1对细胞活力和凋亡的影响。过表达SRXN1和TPS处理显著提高了细胞活力，而过表达SRXN1和miR-375细胞活力无差异(图)5 (c))．与TPS处理相比，过表达SRXN1与TPS处理的共同作用使细胞凋亡率降低，但当SRXN1与miR-375共表达时，细胞凋亡率没有差异(图)5 (d))．qPCR和免疫印迹结果表明SRXN1超表达与TPS治疗bcl - 2的表达增加,细胞凋亡蛋白的抑制剂,和伯灵顿的表达减少,caspase-3 proapoptotic蛋白质,而同时过度SRXN1和mir - 375恢复bcl - 2的表达水平,伯灵顿,caspase-3水平提高到仅添加TPS时的水平(图)5 (e)和5 (f))．

4.讨论

作为食物来源的多糖，TPS广泛存在于各种茶中，如红茶、绿茶和深绿茶[21并已被证明具有许多生物学功能。此外，我们在本研究中证实了TPS可在体外减轻OGD/ r诱导的AS凋亡，并验证了其可能的分子机制。

脑缺血再灌注引发一系列炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，导致血脑屏障的破坏，导致脑水肿，神经损伤加重。有证据表明as衍生因子在脑损伤后血脑屏障的破坏和恢复中起着关键作用[22］．AS一直被用作脑疾病的主要治疗靶点，研究表明，在各种实验动物模型中，更好地控制AS有助于减少脑损伤[4］．因此，对于保护血脑屏障的完整性至关重要。我们的研究还证明了TPS治疗的OGD / R-其活动显着增加。

越来越多的证据表明，mirna作为细胞激活和炎症反应的关键调节器[23］．guo等人。[24]报道miR-375通过靶向HIGD1A诱导细胞ROS产生和凋亡。MiR-375 (MiR-375)在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用，通过靶向IGF-1R抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[25］．此外，上调miR-375也可通过靶向ErbB2抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡[26］．我们在本研究中发现，MIR-375可以通过针对SRXN1作为活动调制。SRXN1的抗氧化作用已被广泛报道，并且SRXN1通过调节帕金森病中的谷胱甘肽（谷胱甘肽）保护脑组织免受损伤[27］．此外，诱导SRXN1表达有助于在体外和体内短暂缺血发作后对氧糖剥夺反应的神经元保护[28］．然而，关于SRXN1在脑缺血-再灌注损伤和凋亡诱导损伤中的作用的报道较少。在我们的研究中，我们发现TPS通过miR-375间接调节SRXN1的表达，提示SRXN1对氧化应激引起的AS凋亡具有保护作用。这也为研究SRXN1在脑缺血再灌注损伤中的分子机制提供了依据。

然而，本研究也有一定的局限性。血脑屏障能有效过滤进出大脑的物质，保护大脑免受外部损伤[29］．TPS作为一种大分子，与体内的其他药物一样，可能会受到血脑屏障的限制，无法进入大脑。本研究结果表明，经TPS处理后小鼠的脑损伤明显减轻，这可能与TPS中一些关键的小成分能够通过肠上皮屏障和血脑屏障的膜渗透有关。据报道，血脑屏障的渗透性通过小泡依赖的内吞作用将小分子如脂质运送到大脑[30.］．但有必要进一步确定在TPS中发挥作用的小分子，以促进TPS对脑缺血-再灌注损伤保护作用的进一步研究。此外,考虑到小分子可以通过激活规范microrna的一系列复杂的细胞内信号通路进入细胞后,研究多糖体内的microrna的监管机制也有助于解释多糖发挥抗炎和抗氧化作用。因此，迫切需要找到一种方法，让活性分子通过血脑屏障进入大脑。

综上所述，我们的研究表明，TPS在体内和体外均能减轻脑缺血再灌注所致的AS损伤，其基础是通过调节miR-375/SRXN1轴抑制AS凋亡。这为TPS治疗缺血-再灌注损伤提供了理论依据。

数据可用性

支持这项研究结果的数据和材料包括在已发表的文章中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本文由国家自然科学基金项目NSFC81300346资助。

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