血管紧张素II的生理生化血管反应参数和偏激剂TRV023的作用

摘要

自60年代初以来，孤立主动脉环的血管反应性实验已被广泛应用于生理和药理研究。在这里，我们建议研究者在实验模型中研究血管紧张素II时应注意的几个参数。血管紧张素II是肾素-血管紧张素系统的活性肽之一，通过AT1和AT2受体发挥作用。一些研究试图通过血管反应性实验来了解血管紧张素II受体在血管水平上的作用。然而，由于大量的变化，只有少数反应性研究寻求使用这种方法。因此，本研究的目的是通过血管反应性协议规范血管紧张素II的实验方法。为此，利用器官浴血管反应技术开发了基础张力、浓度区间、单浓度、曲线浓度响应等变量，以及使用同一主动脉环的多个实验。这是首个将血管反应性规程标准化的研究。此外，我们还证明了AT1R的trv023偏配体在血管部位的作用。

1.介绍

肾素-血管紧张素系统(RAS)是维持心血管系统内稳态的关键[1］．在经典的RAS轴中，球旁细胞肾释放肾素的催化血管紧张肽原乳沟形成糖肽血管紧张素I .血管紧张素I转换为血管紧张素ⅱ的血管紧张素转换酶(ACE)删除两个终端肽血管紧张素I .血管紧张素ⅱ(Ang II)是主要的肽形成的经典RAS轴并与血管紧张素1型受体(AT1R)和血管紧张素2型受体(AT2R)结合[2］．

Ang II至AT1R的结合可导致血管平滑肌和内皮功能障碍的血管收缩和增殖等损伤。例如，Ang II至AT1R的结合通过增加NAD（P）H氧化酶活性并产生超氧化物阴离子来损害内皮功能[3.］．总的来说，这些过程会导致心血管疾病的发展。

AT1RS是典型的G蛋白偶联的受体，并通过G蛋白依赖性和独立的途径施加信号传导。AT1R偏置的配体同时竞争地拮抗Ang II刺激的G蛋白信号，同时刺激刺激β- arrestin途径[4］．这种方法已被证明是阻断Ang II如血管收缩和心脏肥厚的不利影响，同时提高对心肌收缩性的有益作用，以及抗污染途径的激活。虽然在临床试验中已经在临床试验中进行了偏压配体，但只有在心脏和肾组织中证实了作用机制[5- - - - - -8］．从未研究过血管组织中的直接效应。

有很多研究使用不同的血管对Ang II反应方案[9- - - - - -12］．在文献中发现的大多数研究仅间接地研究了Ang II在AT1R封锁下进行血管反应性曲线的作用[13，14］．然而，这些研究已经被证明会产生很多不同的结果。研究RAS多肽的血管反应性的重要性也由Lautner等人提出，他们描述了关于Ang 1-7使用血管紧张素-(1-7)标准协议的技术和陷阱[15］．

由于难以标准化和现有的血管紧张素II血管收缩协议的多样性，本研究的目的是使用时间、基线张力和血管紧张素浓度参数来标准化主动脉环中Ang II血管反应性的理想条件。此外，我们测试了TRV023在主动脉环中的作用，这是一种对AT1受体有偏向激动活性的肽。TRV023激活β-arrestin通路，而不是g蛋白，本研究使用它来验证β- arrestin血管效应在体外．

2.材料和方法

2.1。动物

十二周龄雄性Wistar大鼠(鼠形阿尔昆)从巴西圣埃斯皮里托联邦大学中心动物设施获得。大鼠每组5只，置于控制温度(22-23°C)、光照-黑暗周期为12:12小时的塑料笼子中，并自由获取食物和水。总共使用了32只动物。所使用的所有协议和手术程序均符合巴西动物实验学院的指导原则，并得到了圣埃斯皮里托联邦大学伦理委员会的批准(ceua - uves，第011/2014号协议)。

２.２.血管反应性实验

如前所述进行血管反应性实验[16- - - - - -18］．在过量服用硫喷妥钠(巴西圣保罗Cristalia, 200mg /kg, i.p.)后，对大鼠实施安乐死，并仔细解剖胸主动脉，清除脂肪和结缔组织。为了进行反应性实验，主动脉被分成2毫米长的圆柱形段。为了研究血管紧张素II在平滑肌层上的作用，所有环的内皮都被用针摩擦管腔机械地移除。

将胸主动脉的节段放置在Krebs-Henseleit溶液(mM: NaCl 118, KCl 4.7, NaHCO)的器官浴中_3.23日,CaCl₂2 h₂2.5 O, KH₂宝₄1.2，mgso₄-7h.₂o1.2，葡萄糖11,EDTA 0.01)₂和5％的co₂（pH7.4）并保持在恒定基线张力（1g，2g或3g）。使用附加到采集系统（MP100，BioPac System，Inc.，Santa Barbara，CA，U.S.A）连接到采集系统（MP100，BioPac System，CA，U.S.A）并连接到计算机的等距振动器进行记录等距张力。将所有主动脉环暴露两次至75mm KCl（30分钟）以检查容器的功能完整性，以及最大的发育张力。通过乙酰胆碱的不稳定证实了内皮酸去除，以诱导弛豫大于前一次收缩的10％，而不是苯肾上腺素（PHE）。确认肌肉层完整性如果在施用KCl时至少2g，则确认了至少2g。

２.３.累积浓度-效应曲线(CCEC)与血管紧张素II

为了研究对血管紧张素II进行CCEC的最佳间隔时间，主动脉环暴露于Ang II (1nM到10 mM)中，每次浓度应用间隔15、30、60和120秒。

2.4。非抑制浓度曲线（NCCEC）至血管紧张素II

用分离的主动脉环中的单一浓度的单浓度的激动剂进行对Ang II的主动脉收缩。在平衡周期之后，将每个主动脉环暴露于单一浓度的Ang II（1nm至10mm）。当达到高原时，张力恢复到基线时，将考虑最大收缩。

2．5．最佳静息张力的确定

为了研究对Ang II进行血管反应性实验的最佳静息张力，主动脉环用1 g、2 g或3 g静息张力平衡45分钟。然后，将主动脉环暴露于Ang II的CCEC中。

2.6。评估重复CCEC与NCCEC到血管紧张素II

为了研究使用相同主动脉组织两次用于血管反应性实验的可能性，在添加了最后一次浓度的激动剂和获得的效果之后，将组织粉末次数，直至返回基线，并让另外60分钟的平衡周期返回到效果另一个实验（CCEC或NCCEC）。

3. Western Blot.

用血管紧张素II或TRV023刺激主动脉戒指10分钟，然后在RIPA缓冲液中均化（50mM TRIS（pH7.4），0.5％NONIDET P-40,0.2％脱氧胆酸盐，100mM NaCl，1mM EGTA，1mm苯基甲基磺酰氟，1 μ.G / ml抑肽酶，1mM钠钒酸钠和1毫米NAF）。通过以3,000×g和4℃离心10分钟除去不溶性组织。将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶（15％）上并进行SDS-PAGE。电泳后，蛋白质被电转移到硝酸纤维素膜（Biorad Biosciences，USA）中。然后将膜在室温下在封闭缓冲液（5％BSA，10mM Tris-HCl（pH7.6），150mM NaCl和0.1％吐温20）中温育2小时，然后用兔子在4℃下孵育过夜抗MLC和抗P-MLC抗体。使用特定过氧化物酶 - 缀合的二抗检测初生抗体的结合，并使用增强的化学发光试剂（Amersham Biosciences，NJ，USA）用于使用ChemIDoC TM XRS成像系统和软件（Bio-Rad，Biosciences，美国）。使用Scion Image Software（Scion Corporation）分析印迹的带强度。

３.１.统计分析

值表示为平均值±SEM。收缩反应表示为在同一主动脉环中由75mM KCl引起的收缩的百分比。先前使用D'Agostino-Pearson Omnibus正常性测试分析了变量的高斯分布。使用非线性回归分析构建和分析拟合浓度 - 反应曲线。不同组之间的统计比较是通过差异（ANOVA）的一种或双向分析来进行的，然后是Bonferroni的后HOC测试。具有值的手段之间的差异具有统计学意义(统计软件:Prism 7.0, GraphPad software Inc.)。

4.结果

4.1。CCEC改变血管紧张素II浓度之间的间隔时间

我们首先评估了CCEC中血管紧张素II浓度之间的最佳间隔时间。每个血管紧张素II浓度之间的间隔为15、30、60和120秒。数字1总结各时间间隔内主动脉环的收缩反应Ang II。根据浓度-反应曲线的两个主要药效学参数，与其他时间间隔相比，60秒间隔表现出增强的收缩反应。每60秒应用一次浓度达到最高Rmax(15秒，44±5%;30秒，38±3%;60秒，54±3%;120秒，3±1%，图1)以及最高的灵敏度(pEC₅₀: 15秒，5.6±0.2 M;30秒，5.8±0.1 M;60秒，6.6±0.1 M;120秒,没有;−log M Ang II).当间隔120秒应用Ang II时，没有观察到响应。

4．2.NCCEC对CCEC对Ang II

还比较了CCEC与NCCEC协议中获得的最大响应。数字2两种方法的最大反应没有差异(CCEC, 56±3% vs NCCEC, 60.0±3%的KCl收缩)。然而，在NCCEC方案中，较低浓度(10^-8M: CCEC, 0±3% vs NCCEC, 21±8%;10点^-7M：CCEC 12±2％VS NCCEC，39±6％， ）。

4.3。重复血管反应性实验的影响

我们还评估了使用同一主动脉环(CCEC II和NCCEC II)对Ang II进行可行的第二次CCEC或第二次NCCEC的可能性。因为在120秒间隔内，CCEC I未观察到收缩(图)1），未进行该间隔的CCEC II。图3(一个)- - - - - -3 (c)总结Ang II诱导CCEC I和CCEC II主动脉环收缩的结果。与CCEC i相比，CCEC II的主动脉环对Ang II的最大收缩反应降低R._马克斯(15秒,−51%;30秒,−57%;60秒,−74%)。数字3 (d)显示了NCCEC I和II的结果。与CCEC协议相比，NCCEC协议的损害似乎更低。与NCCEC II相比，NCCEC I的最大收缩反应仅下降17%。最后，为了证明这种反应模式是特异性的Ang II，血管反应也与肾上腺素能α.1-激动剂吩妥杂烩，结果表明，CCEC II与CCEC I没有损伤（图3（e））。

4.4。静息张力效应

我们还测试了静息张力在血管反应对Ang II的影响。数字4(一)比较不同的静息张力。在2g时的响应(R._马克斯：69.7±4％;压电陶瓷₅₀ : 6.92 ± 0.13–logM) of resting tension of aortic rings did modify the sensitivity and the maximal response to Ang II when compared with 1g (R._马克斯: 64.9±5%;压电陶瓷₅₀：6.45±0.07-logm）和3g（R._马克斯: 64.8±4%;压电陶瓷₅₀：6.86±0.08 logm）。

为了证明这种反应是针对Ang II的，CCEC对苯肾上腺素的反应也在静息压力为1 g、2 g和3 g时进行，在不同静息压力下对苯肾上腺素的最大反应和敏感性没有观察到差异(图)4 (b)）。这些数据表明，静止张力显着导致血管响应性与Ang II。

4.5。AT1的作用β- arestin - 偏见的信令

接下来，我们测试是否激活β抑制素通过AT1R会导致血管收缩。两个CCEC(图5（a））执行NCCEC协议（图5（a））显示出对TRV023没有显着的收缩。这些数据表明Ang II诱导的血管收缩是G蛋白依赖的β-arrestin独立。

进一步开发β-arrestin独立通路在Ang ii诱导的血管收缩，肌球蛋白轻链磷酸化(MLC)也被分析6结果表明，只有Ang II(而非TRV023)能诱导主动脉环p-MLC磷酸化。

5.讨论

在这里，我们研究了血管反应性测定中的几个参数。我们观察到60秒是血管紧张素II浓度之间的最佳间隔时间。我们还观察到2克是最佳休息张力，并且执行2个血管反应性曲线是不可行的。最后，我们观察到建立血管紧张素II的NCCEC浓度的曲线也是可能的，并且不会干扰RMAX或PEC₅₀．

首先，我们利用累积浓度-反应曲线显示血管收缩，根据每次应用药物之间的时间，大鼠主动脉环的血管紧张素II，并观察Ang II的效果是理想的，每次应用Ang II大约60秒。较短的时间(15或30 s)不能诱导整个收缩，这表明pD2表达的效力较低和较低R._马克斯．另一方面，即使在低Ang II浓度下，每个ANG II应用程序之间的持续时间较长的曲线也没有显示出收缩。这可能是由于AT1R的脱敏，表明对血管紧张素II的血管收缩更多地取决于Ang II浓度之间的时间，而不是施加的Ang II的浓度。

接下来，我们证明了非累积Ang II曲线在低浓度下比累积曲线发展更大的收缩力。在我们的研究中，我们还证明了无论单浓度或累积浓度-反应实验，血管紧张素的血管反应在第二个实验中较低，但与浓度响应相比，单浓度时的损伤要低得多，这表明，当需要在同一环上执行两条曲线时，单浓度可能是最明显的。Linder等人的研究表明，这种CCEC II的钝化效应是由于Ang II诱导的主动脉环的速叶性收缩反应[12］．

我们的团队已经发表了[19，20.等[21- - - - - -24研究AT1R在心血管系统中的机械敏感特性。在这项研究中，我们证明了这一点离体主动脉环的伸展改变血管对Ang II的反应性。基础张力2 g较基础张力1 g有较高的EC50和Rmax。2010年，Liu等人[25表明机械牵张可增强Angⅱ诱导的平滑肌细胞增殖在体外．2014年，Tang等人[26]显示AT1R信号通过膜拉伸的变构调控。他们显示了不同的ERK1/2激活的Ang II取决于细胞的拉伸，表明较高的敏感Ang II作为较高的初始细胞拉伸。2016年，Abraham等人[27]发现，缺乏AT1R的小鼠无法产生Frank-Starling力来响应心容量的变化，这揭示了AT1R信号通路在心脏的机械转导中至关重要。然而，我们是第一个在功能性血管系统中显示AT1R力学特性的。这在高血压或中风等疾病中可能很重要，在这些疾病中，RAS受体阻滞剂即使在Ang II浓度没有显著增加的情况下也可能发挥作用[28.，29.］．

除了标准化血管对Ang II的反应协议，我们还旨在研究AT1R (TRV023)的偏置配体对血管收缩的影响，类似于Ang II。我们和其他人已经研究了它对肾脏的影响[7和心脏系统[5- - - - - -8];然而，这是第一个显示其对血管系统直接影响的研究。我们发现，尽管TRV023也与AT1R结合，但它并没有引起血管收缩，也没有引起MLC2的磷酸化，这表明Ang II的血管收缩作用是g蛋白介导的。我们没有观察到TRV023的直接血管扩张作用，但我们使用了无内皮主动脉，血管没有预缩。未来的研究应该在有内皮和预缩血管的情况下进行这些研究，以解决这些问题。TRV027(和TRV023)是AT1R的“偏置”配体，选择性拮抗血管紧张素II的负面作用，同时保留AT1R刺激的潜在促收缩作用。在细胞和啮齿类动物模型中取得多项阳性结果后，研究人员启动了BLAST-AHF (Biased Ligand of the Angiotensin Receptor Study in Acute Heart Failure)，旨在确定TRV027的安全性、有效性和最佳浓度，以推进未来的研究。然而，在621例患者入组后，该IIb期剂量范围研究在30天随访后并没有改善临床状况[8，30.］．在这里，我们表明AT1R的血管收缩效应是依赖于g蛋白的，更重要的是TRV没有血管收缩效应。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

利益冲突

作者宣布没有利益冲突。

作者的贡献

Marcos André Soares Leal和Thanisia de Almeida对这项研究做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了FundaçãodeAmpearoApesquisa DoEspíritoSanto（Fapes，0602/2015），Conselho Nacional deCiênciae Tecnologia（CNPQ，479160 / 2011-2），以及媒体Estadual de Santa Cruz（Uesc）（授予No。00220.1100.1866）。ECV由CNPQ（BOLSA PQ-1D，303001 / 2015-1）的补助金提供支持。

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