新型含二甲基乙酰胺配方改善牙周炎大鼠眶下麻醉效果

抽象的

背景．评价含有新型二甲基乙酰胺衍生物，抗氧化剂和血管收缩剂的制剂的急性毒性和局部麻醉活性在慢性牙周炎大鼠中。方法．以2%水溶液为溶剂，研究了新型含二甲基乙酰胺麻醉剂LHT-15-32。对小鼠进行了急性静脉和皮下毒性试验。测定实验性牙周炎大鼠上第二磨牙的痛敏阈值。用化学发光法测定大鼠牙龈黏膜的氧化应激活性和总抗氧化能力。通过牙周组织形态学检查评价局部变化。组织il - 1β通过酶联免疫吸附测定定量评估IL-10和TNF-α浓度。LHT-15-31在分离的神经元中研究了Na-Blocking活性Limnaea stagnalis'Pagapharyngal神经节。孤立的坐骨神经Rana Radibunda.用不同浓度的LHT-15-32灌注，以评估其电导率。使用统计分析，并将连续变量呈现为平均值±平方偏差。使用ANOVA确定分布的正常性。采用Newman-Keuls参数标准进行组间比较。LD₅₀索引通过探测分析计算。结果．LHT-15-32急性静脉内和皮下毒性低于其活性物质。眶下给药的制剂诱导深牙科麻醉，持续超过70分钟并激活局部抗氧化防御系统并减少IL-1β牙龈组织中的水平。LHT-15-32在给药后五天评估的大鼠中触发的组织恢复。在10⁻⁶到10.⁻³ M concentration, LHT-15-32 inhibited sciatic nerve conductivity and blocked Na⁺孤立神经元的通道以剂量依赖的方式。结论．该配方可作为一种安全有效的上颌磨牙牙周炎麻醉方法。

1.介绍

现代临床实践，尽管在创造新的局部麻醉(LA)和优化将药物传递到暴露部位的技术方面取得了明显的成功，但在实现LA的最佳镇痛效果方面仍存在困难[1］.缺乏牙科缺乏洛杉矶功效的最常见原因之一是，几乎总是将La给予牙髓，根本区域，牙周或肺泡区域的炎症过程的患者[1，2］.

在牙髓炎或根尖牙周炎期间，使用浸润法或神经阻滞时，医生往往在诱导足够深度和持续时间的炎症牙齿麻醉方面遇到很大困难[3.］.临床研究在19-56％的患者中展示了30-45％或较低的成功，甚至在经验丰富的临床医生产生的麻醉效益的情况下，较低的肺泡神经阻滞期间较低磨牙患者的患者4］.脸颊和舌头的浸润麻醉的组合既不是，传统的神经块都伴随着操纵效率的增加。因此，现在牙科充足的麻醉问题是临床和实验药物学家的重要挑战[1，4］.

Lidocaine历史悠久的成功用途作为洛杉矶，因为它已首次在20年代中间进行管理^th世纪[5］.利多卡因通过可逆封闭Na抑制神经电导率⁺由于其抗氧化特性，它能通道和稳定细胞膜。作为单一疗法或与血管收缩剂联合使用，除局部发炎外，麻醉效果令人满意[1］.

该研究的目的是评估含有新型二甲基乙酰胺衍生物，抗氧化剂和血管收缩剂的急性毒性和La活性，慢性牙周炎大鼠。

2。材料和方法

2.1。伦理

这项研究符合GLP标准和欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约的所有要求。该研究方案已于2017年7月6日由俄罗斯莫斯科的Sechenov大学生物伦理委员会审查并批准(会议编号7,reg。不。6/7/2017-11)。

２.２.药物配方

新颖的制剂（实验室代码：LHT-15-32）已经在药物化学和生物活性化合物（AUSC BAC，俄罗斯AUSC BAC，俄罗斯）的药物化学和药物设计部门开发为含有N-乙酰基 - 的2％水溶液L-谷氨酰胺2-二乙基氨基-2'，6'-二甲基苯乙酰胺（实验室代码：LHT-4-00，AUSC BAC;化学纯度：99.75％）作为活性物质。每1mL溶液含有2mg乙基 - 甲基 - 羟基吡啶丙酸酯（EMHPM）和肾上腺素1：200,000。将LHT-15-32的药理性能与单独溶解在蒸馏水中的LHT-4-00进行比较前临时利多卡因(利多卡因HCI, 20 mg/mL, 20 mL, Hospira公司，美国)。这两种对照药物都在2%浓度下进行了研究。引入前，根据溶液的体积和浓度，分别测定各试验溶液的pH值，并用8.4%碳酸氢钠调整至7.35。

2.3。动物和生物对象

55只重18-20克的雄性白鼠和15只青蛙(Rana Radibunda.）从俄罗斯科学院（RAS）的实验室动物养殖设施获得。在RAS（俄罗斯）的理论和实验生物物理学研究所的动物养殖设施中购买了六十五个Sprague-Dawley男性大鼠。将动物保持在无病原体和自然的日光循环下。提供无菌食品和水随意，保持室温(25±2℃)和湿度(60±10%)。将小鼠随机分为11组进行毒理学实验。将50只大鼠随机分为5组，每组10只，分别为完整大鼠、对照组、利多卡因、LHT-4-00和主组;15只动物分为3组，每组5只(完整组、对照组和主要组)，进行形态学检查。将3.5 cm长的青蛙坐骨神经标本分离，在22°C的Ringer溶液中保存30-40分钟，然后进行刺激。从咽旁神经节分离出无关神经元Limnaea stagnalis．

2.4。急性毒性试验

如前所述评估了LHT-15-32急性静脉内（IV）毒性，通过估计平均剂量（LD_100.），导致动物死亡（GAD，1990）。制剂皮下（SC）毒性（LD₅₀)，如前所述，LHT-15-52注射14天后分配给确定剂量组小鼠[6］.

2．5．实验性牙周炎建模

实验牙周炎在麻醉(硫喷妥钠，山德士，GmbX，奥地利;40 mg/kg, IV)将雄性Sprague-Dawley大鼠分配到所有组，除了一个完整的动物，用丝线结扎第二上臼齿(5-0,Ethicon Inc.， USA) [7］.

2.6。牙齿麻醉评估

第15天，麻醉动物(硫喷妥钠，SANDOZ，奥地利;40 mg/kg, IV)放置在SR-5R (Narishige Co, Ltd, Japan)配备便携式钻机的立体定位系统的加热平台上。在第二上臼齿上钻孔两个直径0.3 mm，深度3.0-3.5 mm的孔，其中铂刺激电极(ADInstruments, USA)的游离端用塑料填充物滴固定。电极的另一端从动物肩胛骨颊部皮肤上的孔抽出，用荷包皮缝线固定。4天后，将电流强度从0.1增加到10 mA (BIOPAC MP-160, BIOPAC Systems Inc.， USA)的矩形脉冲(100 imp/s for 5 s)应用于牙齿，以达到动物运动反应和发声所记录的疼痛敏感阈值(PST)。基线PST登记后10分钟(PST零水平)，在眶下给予试验溶液(0.2 mL)。如果5 s长10 mA刺激没有引起动物反应(100%的PST水平)，则建议完全麻醉。

2.7。局部氧化应激测定

我们使用Fe诱导的化学发光来评估氧化胁迫活性（OSA）和总抗氧化能力（TAC）在LA水平测量后的第二天在La水平测量后的大鼠均匀的牙龈粘膜组织的匀浆中，如前所述[8］.

2.8。酶联免疫吸附试验（ELISA）

IL-1β通过大鼠白细胞介素1通过定量ELISA检测IL-10和TNF-α浓度在大鼠牙龈组织匀浆中检测到β（CSB-E08055R），大鼠白细胞介素10（CSB-04595R）和RAT TNF-α（CSB-11987R）ELISA试剂盒（CUSABIO TECHNOLOGY，LLC，CHINA）和STATFAX 4200自动阅读器（美国）。

2.9。坐骨神经电导率测定

坐骨神经标本由含氧Tyrode溶液（mm：NaCl，145,0; KCl，4,0; MgCl₂，1,0;CACL.₂, 80;三,5。0;葡萄糖,10。0;pH 7.3-7.5)，含10⁻³, 10⁻⁴, 10⁻⁵或10.⁻⁶M浓度的LHT-15-32在22-24°C。为了产生中度酸中毒，用盐酸将Tyrode溶液的pH调至6.5-6.7。采用镀金黄铜电极(ADInstruments, USA)和BIOPAC MP-160系统，通过增加电流强度的线性脉冲刺激样品。测量动作电位(AP)振幅，以百分比表示。

2.10。NA.⁺通道阻塞活动

我们采用整细胞结构的patch-clump方法通过Na访问离子电流⁺未分化神经元的通道。用含氧溶液(mM: CsCl, 120;Tris-OH, 2与pH 7.3-7.4)。外膜表面灌注LHT-15-32溶液(mM: NaCl, 110;MgCl₂和Tris-OH, 2, pH 7.5) [9］.

2.11。形态学评价

为了评估局部形态学变化，在LA评估后五天检查了从完整，对照和用硫钠过量过量过量的大鼠受影响的大鼠受影响的大鼠的软组织。通过标准程序制备显微镜载玻片：将组织固定在10％中性缓冲福尔马林中并嵌入石蜡（Leica LP 1020组织处理器，德国）。然后，通过以下脱氨烷化和染色，进行石蜡块的切片（Leica RM 2265，德国），并用苏木精和曙红染色。通过带有数码相机DMC5400（德国）的光学显微镜徕卡观察三微米的组织载玻片。

2.12。统计分析

使用SPSS（版本16.0）进行所获得的数据的统计处理[10.］.连续变量用均值(M)值±方差(SD)表示。通过单因素方差分析(ANOVA)确定分布的正态性。采用Newman-Keuls参数标准进行组间比较。LD₅₀通过探测分析计算索引[6］.

3。结果与讨论

3.1。结果

小鼠施用IV的急性毒性为205±7mg / kg与LD_100.其活性物质的指数仅平均108±12 mg / kg（ ，数字1）.LD₅₀用于SC途径的配方及其活性组分LHT-4-00的指标显着高（657±21 mg / kg和297±20 mg / kg，分别为LHT-15-32和LHT-4-00）比IV的行政途径。

牙周炎大鼠经眶下注射利多卡因后出现中度牙理性麻醉，持续时间不超过17.3±2.3 min(图)2）.LHT-4-00深受麻醉牙齿，令人满意的麻醉迅速开始。止痛药的持续时间平均为32.4±3.4分钟（与利多卡因相比)。制剂在眶下注射后诱导完全麻醉32.1±1.7分钟。主要组大鼠在刺激72.1±2.6分钟内没有对疼痛激励作出反应（与Lidocaine和LHT-4-00的相比）。

牙周炎大鼠牙龈黏膜OSA水平较正常动物升高3倍以上1)，而TAC则按比例减少。所有测试的溶液在眶下给药后一天引起局部氧化应激活性的变化。利多卡因组大鼠牙龈组织OSA降至6.4±0.7 × 10^3. imp/s, LHT-4-00 to 5.3 ± 0.4 × 10^3.imp/s，而LHT-15-32为3.2±0.3 × 10^3. imp/s (与利多卡因相比)。利多卡因组TAC值为1.7±0.4 × 10^3. imp/s, in the LHT-4-00 group 3.9 ± 0.3 × 10^3. imp/s, and in the main group 4.7 ± 0.5 × 10^3. imp/s (与利多卡因相比)。牙周炎与IL-1两者有关β和TNF-α高度随着IL-10组织水平的凹陷。与Lidocaine集团不同，在主群IL-1βTNF-α组织水平显著降低，IL-10浓度保持不变(表1)1）.

在生理和中度酸中毒条件下，灌注lht -15-32溶液后坐骨神经标本AP振幅呈下降趋势(图)3.）.LHT-15-32 10⁻⁶到10.⁻³ M concentration applied at the outer side of the neuronal membrane in a dose-dependent manner blocked Na channels of isolated neurons (Figure4）计算的欧共体₅₀7.78×10⁻⁵ M.

完整牙齿的动物牙龈组织的形态学评价没有变化：用正常鳞状上皮覆盖粘膜。粘膜下是由结缔丝纤维，成纤维细胞和毛细血管组成，淋巴细胞数量有限。牙周韧带被保存（数字5（a）和5（b））.实验性牙周炎表现为中性粒细胞浸润和牙周组织溶解(图)5（c）和5（d））.LHT-15-32的眶下施用在主要组大鼠撞击的上磨牙周围触发软组织恢复（图5（e）和5（f））.我们观察到它被鳞状上皮粘膜覆盖。粘膜下层和牙周韧带含有成熟的肉芽组织，内有大量成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和毛细血管。

3.2。讨论

许多从业者在牙周炎患者的麻醉牙齿中都经历了La行动的失败。在操纵期间增加不适甚至可以导致临床结果不良和不令人满意的结果[11.］.提出了几种原因来解释牙科诊所中炎症过程的洛杉矶效应。其中，（a）对外周血管系统的影响;（2）由于局部氧化应激激活，对伤害患者的损害;（3）降低LA的生物学目标的敏感度最重要的是[1］.新型配方LHT-15-32已经开发出来解决其中一些，因此提高了牙科实践中疼痛控制的疗效和安全性。

该制剂含有二甲基乙酰胺（LIDOCAINE）（LHT-4-00）的N-乙酰基-L-谷氨酸，具有改善的药理学性质（例如La功效的深度和持续时间），作为活性组分[12.］.该研究结果表明，与LIDOCAINE相比，在牙周炎的动物中的制剂延长了LA效果，而且没有LHT-4-00：LHT-4-00：LHT-15-32诱导缺失后的全身麻醉32.1±1.7分钟，不少于72.1 ± 2.6 min of its duration. As体外实验表明，LHT-15-32以广泛的浓度抑制分离的神经电导率（10⁻⁶-10⁻³ M) applied at the outer side of the neuronal membrane blocks Na channels in a dose-dependent manner. Nevertheless, satisfactory pain control in this case cannot be explained only by Na⁺通道阻塞和神经电导率抑制，因为这两个参考药物都是类似的作用[13.］.

合理的解释可能与配方中的抗氧化剂和血管收缩成分有关。Tsuchiya等人已经证明了细胞膜氧化应激和LA活性之间的直接相互关系[1］.LHT-15-32更有效地平衡大鼠牙龈组织中的OSA和TAC，而不是其活性成分作为单一疗法。值得注意的是，降低局部牙周病和牙龈炎症过程可以直接与作为药物安全的LA改善相关[14.］.cunha等。表明了IL-1的关键作用β炎症相关的痛觉过敏症的TNF-α[13.，而Zhang等报道IL-10在牙周炎患者牙槽骨修复中发挥了足够的作用[15.］.降低il - 1βLHT-15-32注射后的一天和TNF-α水平显示出细胞因子调节的药物受累，因此批准药物的抗炎性能。急性毒性数据与行动现场的局部形态学变化相结合，可以为研究人员提供有关LA药物安全的宝贵信息。LHT-15-32的急性毒性显着低于其活性物质LHT-4-00，因为通过血管内和皮下给药。同时，暗牙周围软组织的形态学检查显示了在五天前的动物组中的动物组中触发修复的特征。

然而，所提出的制剂并非没有限制。组织和LA药物溶液pH是关键点，并且对LHT-15-32的重要性不太重要。因此，为了实现有效的疼痛控制，应调整制剂的pH值前临时，这与某些不便相关。

总的来说，所提出的配方可以被认为是用炎症变化麻醉牙齿的有效和安全的工具。

4。结论

Novel formulation LHT-15-32 is less toxic than its active substance and lidocaine, induces deep and long infraorbital anaesthesia of rats’ upper molar with periodontitis, depresses oxidative stress reaction and inflammatory process in gingival tissue, and inhibits isolated nerve conductivity under the condition of moderate acidosis due to Na⁺电流阻止。因此，制剂可以被认为是牙周炎中牙齿麻醉的有效和安全的方法。

数据可用性

用于支持本研究结果的LHT-4-00物质的摘要已存放在俄罗斯联邦服务中的知识产权储存库（http://www1.fips.ru/ofpstorage/doc/izpm/runwc1/000/000/002/657/613/657/613/1-026576/657/613/657/613/6-02657613-00001/document.pdf.）.

利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

致谢

俄罗斯政府研究委员会的补助金部分得到了部分支持这项工作（授予第NO。2017-14-N08-0036）。作者非常感谢他们的同事，以便对稿件和他们的实验室工作人员进行致力于忠诚的援助。

参考

1. H. Tsuchiya，“牙齿麻醉存在炎症：药理学机制减少局部麻醉剂的疗效，”国际临床麻醉学杂志，卷。4，pp。1059-1067，2016。查看在：谷歌学术
2. G. George，A. Morgan，J. Mechan等，“牙科麻醉的注射局部麻醉剂”，Cochrane数据库系统评论（在线），卷。7，pp。1-5,2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术
3. M.-h.KARM，F. O. Park，M.Kang等人，“2％利多卡因HCL与不同肾上腺素浓度的疗效和安全性比较局部麻醉的参与者接受突出的下颌三臼齿的外科提取”医学，第96卷，第2期21, p. 6753, 2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
4. G. Gazal，R.Alharbi，W. M. Fareed等，“牙齿提取期间4％牙龈的发病麻醉时间和注射剂的比较，”Saudi麻醉学杂志，卷。11，不。2，pp。152-157,2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
5. S. F. Malamed，“局部麻醉剂：牙科最重要的药物，临床更新2006，”加州牙科协会杂志，第34卷，第971-986页，2006。查看在：谷歌学术
6. S. C. Gad，“毒理学的模型选择：原则与实践”美国毒理学学院学报，第9卷，第5期。3，第291-302页，1990。查看在：出版商的网站|谷歌学术
7. L.S.Coimbra，J.P.Steffens，M.N.Muscará，C.Rossa Jr.和L.C.Spolidorio，“抗血小板药物减少了牙周病大鼠模型中的免疫炎症反应”牙周研究杂志，卷。49，没有。6，PP。729-735,2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术
8. A.A.Dzhatdoeva，A.M.Polimova，E.V.Vaskurnina和Y.Vladimirov，“组织化学发光作为评估线粒体的超氧化物自由基产生能力的方法”俄罗斯国立医科大学公报，卷。1，不。1，pp。49-55,2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术
9. A. Beyder，P. R. Strege，C.伯纳德和G.Farrugia，“膜可渗透的局部麻醉剂调制Nav1.5机械敏感，”渠道，第6卷，第2期4, pp. 368 - 368, 2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术
10. S. A. Glantz，生物统计学中的引物，McGraw-Hill公司，Inc。，纽约，纽约，美国，第7版，2012。
11. G. Mayor-Garcia，E.Valmaseda-Castellon，J.Arnabat-Dominguez，L.Berini-Aytes，以及C.Gay-Escoda，“Oraqix的麻醉效果与飓风和安慰剂进行疼痛控制非手术牙周治疗，“Medicina Oral Patología Oral Y Cirugia bual， vol. 19, pp. e192-e201, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术
12. A. Novikov，E.Blinova，E. Semelva等，“关于一些二甲基乙酰胺化合物的局部麻醉作用”药理研究结果，卷。4，不。4，pp。1-8,2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术
13. T. M. Cunha，W.A.Verri Jr.，J.S. Silva，S.Poole，F. Q. Cunha和S. H.Ferreira，“细胞因子的级联介导老鼠中的机械炎症性高疾病，”国家科学院的诉讼程序，卷。102，没有。5，PP。1755-1760,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术
14. J. Soares de Oliveira，M.E SilvaConceiçãoPinto，L. de Arajo de Bastos Santana，A. Santos Bezerra Pinto，D. di Lenardo和D.Fernando Pereira Vascomcelos，“药用植物诱导牙周炎的生物学效应”：a系统评价，“国际牙科杂志，卷。2016年，第2719879，10页，2016年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
15. 白介素-10抑制骨吸收:牙周炎和其他骨流失疾病的潜在治疗策略，"生物化研究国际，卷。2014年，文章ID 284836，p。2014年5日。查看在：出版商的网站|谷歌学术

版权

版权所有©2020 Ekaterina V. Blinova et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。