所述Rossello et al。 8),获得胚胎成纤维细胞,新鲜鸡蛋孵化在37°C 2 - 4天,小鼠胚胎收集胚胎第12天。胚胎提取和腹部和头部分离钳。剩余的胚胎分离,使胰蛋白酶化与0.25%胰蛋白酶EDTA (Gibco)在37°C到单个细胞悬液。胰蛋白酶是KO中和后DMEM (Gibco 10829)加上15%的边后卫(HyClone)。细胞5 - 7分钟1500 rpm旋转,上层清液吸气。细胞被镀在15厘米细胞培养板,每板1胚胎KO DMEM + 15%的边后卫和孵化39°C(鸡)或37°C(鼠标),分别在5%的股份有限公司₂大气与21%的氧气。两天的潜伏期后,细胞通过一次在一个1:4稀释和冷冻或转染两天后,如下所述。

所述Rossello et al。 8)、鸡肉或小鼠胚胎成纤维细胞转导2我+修改中(见下文)STEMCCA病毒载体包含鼠标Oct4、Sox2, Klf4,原癌基因的基因据ViraDuctin慢病毒转导工具包(ltv - 201) [ 9]。我们通常转导12 - 24独立成纤维细胞复制文化12-well细胞培养板(康宁,3.8厘米²)。细胞转导塞斯克媒体一周后,然后通过在许多不同的媒体组合条件的试验和错误4为每个条件独立复制,其中五个比较(表内报告 1,见下文)。由于不同媒体条件下同时进行4井12 - 24孔板,这对实验板控制,孵化器,或其他变量。

BRL条件媒体+(布法罗鼠肝)。90% KO DMEM(σ)+ 10%的边后卫的先决条件(Hyclone)和水牛鼠肝细胞3天来创建BRL条件媒体。然后每100毫升BRL条件媒体,我们添加了以下标准细胞培养成分(生成总数150毫升):KO DMEM(15毫升)的边后卫(7.5毫升),100毫米丙酮酸钠(1.5毫升),100 x不必要的氨基酸(1.5毫升;σ),100 x Penicillin-Streptomycin(1.5毫升,σ),100 x核苷(1.5毫升,微孔),100 x Glutamax (250 μL,生活技术),和beta-mercaptoethanol (190 μL,σ)来生成“BRL条件+”媒体,与最终的浓度列在表中 1。这种介质用于种植鸡原始生殖细胞(包括;( 10),除了我们省略了鸡血清。

塞斯克(鸡胚胎干细胞)媒体。这个媒介是基于Samarut和疼痛 11),它是用来支持鸡ESCs扩散。它是用来培养我们最初iPSC-like禽细胞持续了报告的第五段Rossello et al。 8]。它由标准媒体的边后卫和Glutamax浓度的差异和生活(微孔LIF2010)和下面的重组细胞因子(表补充道 1):rhIL6 (Peprotech 200 - 06), rhsIL6Ra (Peprotech 200 - 06 - r), rmSCF (Peprotech 250 - 03), rhIGF1 (Peprotech 100 - 11),和rhFGF2 (Peprotech 100 - 18 - b)。从人类生活的目的和重组细胞因子(h)和鼠标(m)抑制分化。

2我+(3抑制剂)+ 人生如果媒体我+ (2)。2我+媒介是基于 12- - - - - - 14),包含3在哺乳动物细胞的化学物质抑制细胞分化。标准3 i和生活媒体包括生活激活STAT3 CHIR99021 GSK3抑制,抑制MEK PD0325901, PD184352抑制FGF受体酪氨酸激酶。我们发现用A83-01代替PD184352,抑制及,导致健康寻找增殖殖民地( 13]。在我们的实验中,我们使用标准的媒体条件(除了的边后卫上升到15%,因为我们观察到细胞增殖快的边后卫在15%),然后添加生活+三个抑制剂:PD0325901 (Stemgent) CHIR99021 (Stemgent)和A83-01 (Tocris Biosci) ( 12]。

塞斯克和2我+媒体。这个媒介是塞斯克和2 +(表 1)。我们使用标准的媒体环境,包括15%的边后卫的水平,然后添加生活,2我+ (PD0325901, CHIR99021, A83-01)和重组蛋白(rhIL6, rhsIL6Ra, rmSCF、rhIGF1 rhFGF2)在同一浓度。

修改2我+媒体禽细胞。我们尝试各种浓度的变化的生活和我2 +分子获得修改2媒介禽细胞的扩散。这种媒介生成以同样的方式作为我们2我+媒体(表 1),但降低了生活(从1000 U /毫升50 /毫升),增加PD0325901(从0.5 μ米1 μCHIR99021(3米),没有变化 μ从0.5 M),增加A83-01 ( μ米1 μ米)。这个媒介是用于种植更增生性iPSC-like禽细胞持续过去20篇报道( 8和本文的时间仍然激增。

我们在家鼠万能干细胞冷冻股票细胞用于控制实验。他们根据协议中描述生成Rossello et al。 8]。细胞解冻后,他们在与鸡iPSC-like培养细胞与塞斯克或修改2我+媒体。

小鼠成纤维细胞被扩大,使胰蛋白酶化、辐照和储存在液氮整除。辐照细胞解冻并根据需要镀一到五天前使用。一夜之间,成纤维细胞提取鸡被镀在~ 70% confluency所需的细胞培养板上种植鸡iPSC-like细胞。然后mitotically灭活细胞和mitomycin-C(σm - 0503)的浓度为10 μg / mL的媒体为2.5小时39°C。之后,这些细胞被洗3次,1 xpbs (Gibco)和孵化鸡iPSC-like所需一夜之间在媒体上的增长。鸡iPSC-like细胞使胰蛋白酶化(Gibco, 25200 - 056),然后旋转下来镀到mitotically灭活鼠标或鸡成纤维细胞与新媒体。

鸡iPSC-like细胞培养的干细胞和self-proliferating成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶孵化EDTA (Gibco)在室温下30秒,同时轻轻来回摇摆的盘子。胰蛋白酶是修改2我+媒体和中和后板放置在解剖显微镜下。500 μL吸管,然后干细胞殖民地与纤维母细胞分离和抽取到吸管小费。提取的殖民地被放入细胞培养板上的好大约在3 - 5个殖民地每22.1毫米或6.35毫米12-well板或96孔板,分别(康宁)用新鲜修改2 i +媒体。提取的殖民地被培养其他鸡iPSC-like细胞在39°C, 5%的公司₂,21%的氧气。

细胞培养皿或玻璃幻灯片和4%多聚甲醛固定水在室温下10分钟。他们然后用三羟甲基氨基甲烷马来酸盐缓冲液洗2 - 3次(30毫米三pH值9.0)和碱性磷酸酶染色活动30分钟在室温下与刚做好的解决方案包含Naphtol-AS-MX-phosphate(σN5000)和快速红色TR盐(σF2768)与MgCl三羟甲基氨基甲烷马来酸盐缓冲液₂(10%)。他们然后用PBS停止洗的颜色反应和盖玻片Vectashield HardSet安装介质包含DAPI(向量实验室,h - 1500)。

我们试图从鸡iPSC-like生成神经元细胞使用两个不同的协议:(1)干细胞技术ES-Cult装备,使用菜胚状体体方法准确描述(干细胞技术,猫# 28706;生产终止);和(2)一个分化方法修改( 15]。2媒体使用的修改补充,N2 (Gibco 17502 - 048)和B27 (Gibco 17502 - 048),通常用于结合生活(白血病抑制因子)来维持的ESCs的多能性和祖细胞。生活的主要成分是文化条件,帮助细胞保持未分化状态。N2和B27没有生活是用来维持神经元文化和刺激干细胞和祖细胞分化成神经元。使用的方法李et al。 15),有三个步骤。 (1)

我们首先形成拟胚体(EBs) 6厘米板块包含iPSC-like细胞用0.25%胰蛋白酶+ EDTA使胰蛋白酶化(Gibco)。胰蛋白酶是淬火和细胞在1500 rpm。细胞被resuspended在 胚状体的身体形成媒体(见下文)和镀超低附着6-well细胞培养板(干细胞技术,猫# 27145)大约10⁶细胞每4天。2天内,细胞聚集成EBs培养4天以上时,在某些情况下,EBs开始显示cardiac-like节拍零星的节奏。增加细胞浓度每增加了EBs的大小和数量。

胚状体的身体形成媒体。这是标准的培养基没有细胞增殖抑制剂(表 1)。的具体浓度标准成分KO DMEM(81%)的边后卫(15%)、丙酮酸钠(1毫米),不必要的氨基酸(1毫米),Glutamax(1毫米),beta-mercaptoethanol(0.005毫米)和青霉素和链霉素(1毫米)。

过渡的媒体。这个媒介是1:1的混合物标准媒体(表 1,从KO DMEM青霉素、链霉素)和神经分化N2B27媒体基于李et al。( 15),但没有额外的视黄酸。N2B27介质是由1:1的混合物N2和B27媒体,分别存储在使用前。氮气介质由DMEM / F12 (99%, Gibco), N2 (1%, Gibco 100 x)和BSA (0.01%, Fisher);B27由neurobasal媒体(96%,Gibco), B27 (2%, Gibco 50 x) Glutamax(1毫米),青霉素和链霉素(1毫米)和beta-mercaptoethanol(0.005毫米)。所有成分的最终浓度1:1混合过渡媒体N2B27和标准媒体KO DMEM(40.5%)的边后卫(7%)、丙酮酸钠(1毫米),不必要的氨基酸(1毫米),Glutamax(1毫米),beta-mercaptoethanol(0.005毫米),青霉素和链霉素(1毫米),DMEM / F12(24.5%)、氮气(0.25%,Gibco 100 x) neurobasal媒体(24%),B27 (0.5%, Gibco 50 x)。

N2B27神经元分化的媒体。这种媒介是一样的N2B27上面所描述的那样,最终浓度的DMEM / F12(49%)、氮气(0.5%)、BSA (0.005%)、neurobasal媒体(48%),B27 (1%, Gibco 50 x) Glutamax(0.5毫米),青霉素和链霉素(1毫米)和beta-mercaptoethanol(0.005毫米)。

区分神经元上玻璃盖玻片和4%多聚甲醛固定15分钟,用水洗1 x PBS。细胞被permeabilized triton x - 100 1 0.3% PBS 30分钟在室温和阻塞以适当的血清或1% BSA在室温1小时。细胞与初级孵化抗体(NeuN微孔MAB377;MAB1637 TU-20,微孔;或巢蛋白、微孔MAB353) 1小时1:100稀释在PBS然后二次抗体1:1000稀释一小时如下:NeuN加上一个AlexaFluor488荧光二次抗体(分子探针);TU-20巢蛋白和加上一个anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(σ,A3562)然后用快速反应蓝色RR盐(σFBS25)。细胞生长的盖玻片被安装在载玻片上包含DAPI Vectashield越来越多的媒体。我们量化NeuN标记细胞通过计算所有细胞的数量在100 x视图从三个独立的复制,这个数字除以总DAPI标记细胞,然后平均的值。

盖玻片与神经元被转移到现场录制室包含标准细胞外液(140 mM:氯化钠、3氯化钾、2 CaCl₂1.25 MgCl₂1.25不₂阿宝₄、20 d -葡萄糖和10玫瑰)。建立了全细胞记录在一个正直的显微镜使用DIC光学(奥林巴斯BX51WI LUMPLFLN40XW目标)。记录吸量管电阻从3到6 MΩ和系列电阻< 20 MΩ。数据测量和获得b Axoclamp 700放大器和Digidata 1440(分子设备)。内部电极的解决方案包含,毫米,135 K葡萄糖酸,2 MgCl₂EGTA NaGTP 2 MgATP, 0.5, 0.5, 10玫瑰,和10磷酸肌酸(pH值7.35)。细胞是由电流注入试验动作电位的存在。

细胞被剥离下来,RNA提取使用标准工具(Promega SV总RNA隔离系统,Z3105)。鸡iPSC-like细胞生长在我们修改2 i +媒体条件下,控制纤维母细胞生长在同样的媒体,和鸡分化神经元生长在微分媒体。RNA是量化使用NanoDrop 2000 C(热科学、沃尔瑟姆,MA)和存储在−80°C。互补DNA(互补)生产(10 μL 2 x RT缓冲区1 μL 20 x上标2酶;应用生物系统公司)使用MJ四分体系统运行逆转录周期(周期:37°C 60分钟,95°C 5分钟,4°C持有)。互补脱氧核糖核酸被用作模板进行基因表达分析使用BioRad Cx96实时机器与定制TaqMan引物探针(由应用生物系统公司)或自定义引物1 μL SYBR绿色(BioRad) 20 μL反应包含1 μ模板(L ~ 2 μ克/ μL), 10 μL 2 x基因表达主人混合(BioRad大力神,CA)。区分相对神经干细胞基因的表达,不同引物生成的鼠标和鸡物种,使用不重叠的序列。探针包括鸡特定Nanog (ID NM_001146142.1基因5′-CAGCAGACCTCTCCTTGACC-3′,牧师引物3′-TTCCTTGTCCCACTCTCACC-5′), Oct4 (ID NM_001110178基因5′-GGGAAGATGTTCAGCCAGAC-3′,牧师引物3′-GTCTGGTTCTGCAACCGGCG-5′),和Sox2 (ID NM_205188.1基因5′-TTTCCTAGGGAGGGGTATGAA-3′,牧师引物3′-GCAGAGAAAAGGGAAAAAGGA-5′)来确定鸡iPSC-like具备干细胞的细胞;克莱斯勒(双肾上腺皮质激素ID NM_204335基因5′-CGCTGAAAACCGCTTCAGAT-3′,牧师引物3′-ACTGCTCGAGGTCCCATTTG-5′),巢蛋白(ID NM_205033.1基因5′-GCAGAGCCAGAGCGCACCAA-3′,牧师引物3′-CAGGCTCAGCCCCACTGTGC-5′),和beta-tubulin三世(ID NM_001031598基因5′-GGCCTCCTCTCACAAGTACG-3′,牧师引物3′-AAATGAAGTTGTCGGGGCGG-5′)神经特异性;和GMFB(神经胶质成熟因子B基因ID XM_418091.4 5′-CGGGCAGGATGGATTTCTCT-3′,牧师引物3′-GTACTCATTGGCCTCGTGCT-5′)胶质特异性。所有的引物进行了测试和显示效率水平90%以上,符合MIQE指南( 16]。每个也包含10 x RT缓冲区(200毫米Tris-HCl / pH值8.4;500毫米氯化钾),MgCl 25毫米₂,1 μL的互补产品,10毫米核苷酸,iTaq DNA聚合酶。骑自行车的rt - pcr条件如下:48°C 10分钟和95°C十分钟,其次是40 95°C的周期15秒(变性)和60°C 1分钟(退火)。没有模板控制分析运行对于每个引物组,探针和端粒酶试验。18 s rRNA内生控制运行每个样本(TAQMAN男人底漆:猫#真核18 s rRNA HS99999901_S1;应用生物系统公司)。所有的反应都在五胞胎。结果规范化内生18 s rRNA表达式(ABI)和对照组的基因表达水平使用DDCT方法( 17]。方差分析是为每一个物种内的基因表达的变化。统计显著性测定 P = 0.05 。

MTT试验执行标准工具包(Promega SV细胞非放射性细胞增殖测定效价96,G4000)。鸡成纤维细胞和鸡iPSC-like细胞生长在修改2我+媒体。在每个通道后,细胞培养24小时,装备染料溶液添加到每个好和孵化设备协议在37°C为4个小时。之后,增溶缓冲区是添加到每个好/协议和孵化一夜之间,在570 nm和吸光度是阅读。

第一部分我们的研究的目的是找到条件允许我们成长禽流感iPSC-like细胞过去5通道,我们很难在塞斯克媒体( 8]。不同介质条件尝试用各种各样的细胞,包括鸡胚胎干细胞来自伯特兰痛苦,鸡从Marie-Cecile van de Lavoir原始生殖细胞,和鸡肉iPSC我们推导出自己。这里我们报告五个媒体条件比较的目的,使用前面生成的iPSC-like细胞生长在塞斯克媒体包括前面的条件作为基准。对于我们的通用协议,鸡胚胎成纤维细胞转染与STEMCCA磁带包含四个转录因子诱导老鼠,和nontransfected鸡胚胎成纤维细胞被用作控制,在标准媒体条件复制12 - 24井。1周后,细胞通过一次,然后转移到保持最初的四个分化抑制媒体条件复制4:BRL-conditioned另外,塞斯克,2我+,塞斯克,2我+(表 1:看到部分 2详细的媒体作品)。先前的研究显示,我们的结果验证(图中未显示),BRL-conditioned ( 18)和塞斯克媒体( 11维持鸡)是足够的原始生殖细胞(包括)和鸡的ESCs,分别,2我+介质足够维持老鼠干细胞 在体外( 12]。

在我们的实验中,在所有媒体条件下鸡细胞开始形成小iPSC-like殖民地1 st-2nd通道内的增殖细胞(图 1),而成纤维细胞没有。然而,第二和第五章节之间有差异条件(量化表 2)。殖民地BRL-conditioned媒体非常小和黑暗,贫穷,和他们所有人很快开始衰老的第二通道(几周)。衰老特征是看到一些没有剩余的殖民地或增殖的细胞。塞斯克和2细胞i +媒体一直持续到第四段,但在只有~ 50 - 70%的复制,然后他们开始衰老的第五段(表 2)。塞斯克的细胞没有成长更好的我+ + 2,在只有50%的细胞通道6然后停止增长(表 2)。然后我们产生许多其他修改的2我+媒体(2 i + Mod)生活通过系统地降低和增加抑制剂(0.5 μ在媒体上的增量)。我们测试了不同配方的媒体鸡iPSC-like细胞上,我们可以清楚地识别出哪个媒体辅助细胞的增长的第三或第四通道。我们发现降低生活和增加两种抑制剂(PD0325901和A83-01)导致鸡群出现更健康和更大的已经通过第二段与第一段(图 1(e))和增长近20通道(表8所示 2)和一个相似的速度作为我们的鼠标iPSC控制(表 2)。我们老鼠生长良好,增殖的细胞则殖民地塞斯克和修改后的2我+媒体(表 2),这表明与鸡的差异使用塞斯克媒体可能反映了物种差异。

与其他媒体条件下,我们发现鸡的形态学iPSC-like殖民地反复修改2我+媒体通过三个不同的发展阶段。当细胞最初转导,殖民地表现出明显的形状与肤色的中心(图 2(一)),代表鸡胚胎干细胞的形态 8]。大约4 - 5通道后,殖民地在其他媒体条件下开始开始衰老,修改我的殖民地+中失去色素和成纤维细胞开始出现在殖民地的边缘(图 2(c))。殖民地在每个后续段落将持续开始以稳定的速度增长(需要1:2稀释每2 - 3周)第一次没有成纤维细胞,然后将几天后出现。当我们把成纤维细胞在外围机械500 μL吸管( n = 5 ),这个阶段的细胞停止增殖。当我们镀在mitomycin-C-treated或辐照鼠标或馈线鸡成纤维细胞( n = 3 每个),茎状的细胞增殖更显著下降。因此,我们能够保持增长的唯一途径是让细胞修改2 i +媒体产生周围成纤维细胞在生长在这个阶段。然而,8-9th通道后,大多数的殖民地(> 65%±12%)开始失去发展成纤维细胞的形态(图 2(e)),尽管,尽管在我们普通鼠标则和ESCs,仍有少量的纤维母细胞分化文化井。最后,大约12通道后,细胞殖民地开始像老鼠的形态和扩散的细胞则以相似的速度(每7天~ 1:4稀释)和文献中报道小鼠( 3]。我们到目前为止已经能够保持这段的鸡iPSC-like细胞一年多来,而不是1:每2 - 3周2稀释前阶段。所有的殖民地在三个阶段仍然碱性磷酸酶染色阳性(数字 2(b), 2(d) 2(f))和内源性表达鸡同源染色体的干细胞诱导基因(也看到Rossello et al。 8]);周围成纤维细胞没有对碱性磷酸酶染色。因此,我们修改2我+媒体禽细胞不断实现我们的目标的持续增长与发展创造条件的禽流感iPSC-like细胞。

殖民地整个三个阶段也表达了内生鸡同源染色体的干细胞诱导基因(图 3;也看到Rossello et al。 8])和正常核型的最后阶段(见Rossello et al。 8])。我们检查了高度增殖的殖民地。使用中存在3鸡特定探测器与多能性,我们发现相对于nontransduced成纤维细胞,高度增殖的鸡仍然iPSC-like细胞表达高水平的内生Nanog, Oct4、Sox2(图 3);内源性klf-4很低,如早期在正常鸡ESC(图 3;( 8])。因为鸡iPSC-like细胞转导Oct4鼠标同系物,Sox2,原癌基因,和klf-4鸡同系物的表达显著增加,包括Nanog nontransduced基因,表明内生多功能机械仍活跃在最后阶段。同样,MTT检测表明,鸡iPSC-like细胞保留了相当高的扩散(代谢)(图的能力 4)。

我们把细胞,让它过去5日8日,12日和20段落修改2我+媒体和试图分化成神经元。我们第一次尝试了协议由干细胞技术,ES-Cult(干细胞技术,猫# 29706;终止),但发现,尽管他们能够为鼠标,生成neuronal-like出现细胞分化的老鼠细胞的密度稀疏,禽流感拟胚体(第一步)麻烦将这些盘子。然后我们尝试和修改的方法李et al。 15),没有额外的视黄酸,用我们的鸟类标准媒体组合。我们发现,在这个修改神经元分化培养基,鸡iPSC-like分化的细胞经历了五个不同的阶段。

在第一阶段,当鸡iPSC-like细胞(图 5(a))被放置在身体胚状体的形成中、在超低附着盘子,他们脱离底部的板块,成为色素,并组成了一个三维球,也就是说,EB(图 5(b))。当这些EBs然后放入神经过渡媒体对玻璃盖玻片poly-L-ornithine和层粘连蛋白好几天,他们依附于盖玻片,开始变平,(图 5(c))。当他们被放置在N2B27媒体,在接下来的7天内,细胞迁移距离EB和神经突形成过程(图 5(d))。12到14天后N2B27媒体,这些分化细胞神经元形态(图显示清楚 5(e))。剩下的细胞在原始EBs自己了neurobasal-like形态、rosette-like结构(图 5(d);( 19])。

我们已经发现,区分细胞白天7表示NeuN(图 6(我)),一个神经核抗原( 20.]。甚至这样的一些细胞还没有明确的神经过程,表明细胞神经元前体细胞。NeuN标记细胞往往位于远离neurobasal细胞(图 6(f))。的colocalization NeuN细胞核染色(绿色)和DAPI染色(蓝色)表明表达的抗原是正确地主要在细胞的细胞核和细胞质在较小程度上(数据 6(h)和 6(我);( 20.])。在这个阶段,NeuN标记细胞的密度为56%(±11.6%)细胞分化的5日或8通道和56.3%(±5.46%)细胞分化的12日和20的段落。相比之下,井只有开始鸡iPSC-like细胞在一个类似的密度介于0和2 NeuN标记细胞在整个。

经过14天的神经分化,细胞巢蛋白染色,中间丝蛋白,即优先表达在神经元的胞浆soma(图 7(c)) 21),彩色beta-tubulin III (TU-20),这些标签神经元微管通常表达神经元轴突和树突(图 7(d))。TU-20标签允许我们想象的神经过程,在那里可以看到细胞形成连接或至少通过这些过程彼此联系在长距离在盖玻片(图 7(d))。如此长的过程只有在旧文化从14天左右开始。开始鸡iPSC-like细胞没有显示分化过程,没有污点NeuN,巢蛋白,或TU-20(图 6(c)和数字 7(一)和 7(b))。这些结果说明在展览神经元分化的细胞形态和细胞抗原没有出现在开始。

神经元分化细胞的身份进一步支持中存在的神经元与神经元标记doublecortin,巢蛋白和beta-tubulin三世鸡iPSC-like细胞(图 3)明显高于相对表达iPSC和纤维母细胞或iPSC-like控制。我们还发现大大增强表达胶质标记神经胶质细胞成熟分化因子β(GMFB)比成纤维细胞和ciPSC-like细胞。这表明,除了神经元,一些鸡肉iPSC-like细胞可以分化成胶质细胞在神经元分化的媒体。

我们下一个测试是否分化细胞表现出膜兴奋性神经元的特征。我们从视觉控制下的培养细胞全细胞记录,选择与多极neuron-like细胞形态(图 8(一个))。我们patch-clamped 4细胞,3表现出强烈的动作电位。符合神经细胞表型,分化细胞超极化静止膜电位之间的68年和65−−mV。然后我们去极化电流注入current-clamp模式评估动作电位的存在(图 8 (b))。这个持续生成列车诱发的过度动作电位阈值的大约40−−33 mV,高度从78年到86年mV。峰值是快速(宽度一半max, 1.5微秒),还显示突出after-hyperpolarizations(数字 8 (b)和 8 (c))。超极化电流注入产生的分级膜电位的变化表明433兆欧姆的输入电阻。我们记录显示每一个多极细胞类似的发射特性。因此,差异化iPSC-like细胞显示几个电生理特性的神经元细胞类型的说明。