分子 1合成了六个步骤从BPP(计划 1);复合 2合成了根据我们的报告程序 13, 14]。

10、10′ - (1,1′ ——(Pyridine-2 6-diyl) bis (1 h-pyrazole-4 1-diyl)) bis (dec-9-yn-1-ol) ( 3) 。复合 2(0.5克,1.07更易)、Pd(产后大出血₃)₂Cl₂(0.075克,0.106更易),产后大出血₃(0.050克,0.214更易),崔(0.027克,0.144更易)是在一个100毫升two-neck圆底烧瓶。这种固体混合物,高真空脱氧应用通过冷凝器。随后,溶剂干燥三乙胺(15毫升),1、4二氧六环(3毫升),添加到缺氧固体混合物在N₂的气氛。五分钟后,9-dec-yn-1-ol(0.217克,1.41更易)添加和搅拌8 h N₂气氛在80°C。下的溶剂被减压和固体产品通过柱色谱法纯化用5%甲醇/ DCM。与乙醚洗复合后,纯洁 3得到白色固体(80%的收益率)。¹核磁共振(400 MHz, CDCl₃): δ= 8.6 (2 h), 7.9 (m, 1 h), 7.8 (d, 2 h), 7.7 (s, 2小时),3.6 (m, 2 h,哟₂),2.4 (m, 4 h), 1.6 (m, 12 h), 1.4 ppm (m, 12 h)。¹³理化性质(100 MHz, CDCl₃): δ= 149.4,144.6,141.5,129.0,109.5,106.5,92.6,70.6,62.9,32.7,31.9,29.7,29.2,28.8,25.7,22.6,19.4 ppm。傅立叶变换红外光谱(KBr): 3616.86, 3398.88, 3146.18, 3055.52, 2928.21, 2851.05, 1726.45, 1601.06, 1481.46, 1497.1, 1402.38, 1354.15, 1265.42, 1219.12, 1186.33, 1055.16, 1028.15, 972.21, 952.92, 896.98, 864.19, 800.53, 738.80, 706.01, 655.86。质分析 m / z:实验值= 515.0,计算值= 514.2。肛交。计算的。对于C_31日H₄₁N₅O₂:C, 72.20;H, 8.01;13.58 N,发现:C, 72.36;H, 8.12;13.49 N,。

10、10′ - (1,1′ ——(Pyridine-2 6-diyl) bis (1 h-pyrazole-4 1-diyl)) bis (dec-9-yne-10 1-diyl) bis (4-methylbenzene-sulfonate) ( 4) 。悬挂的解决方案 3(0.3克,0.58更易)在DCM(15毫升)和净₃(5毫升),甲苯磺酰基氯(0.443克,2.32更易)慢慢地补充道。反应混合物在室温下搅拌2 h。所有的溶剂蒸发压力降低,原油通过柱色谱法纯化酯层/己烷(2:8)。无色固体化合物 4得到75%的收益率。¹核磁共振(400 MHz, CDCl₃): δ= 8.5 (2 h), 7.9 (m, 1 h), 7.8 (s, 4 h), 7.7 (s, 2小时),7.7 (s, 2小时),7.3 (m, 4 h), 4.0 (m, 2 h,哟₂),2.4(年代,6 h), 2.35 (m, 4 h), 1.6 (m, 8 h), 1.5 (m, 4 h), 1.4 (m, 4 h), 1.2 ppm (m, 12 h)。¹³理化性质(100 MHz, CDCl₃): δ= 149.4,144.6,141.5,133.2,129.8,128.9,127.8,109.6,106.5,92.5,70.6,28.9,28.6,25.3,21.6,19.4 ppm。傅立叶变换红外光谱(KBr): 3483, 3148, 3109, 3055, 2932, 2856, 1718, 1604, 1469, 1398, 1358, 1288, 1219, 1176, 1099, 1024, 951, 806, 777, 731, 661。质分析 m / z:实验值= 684.6,计算值= 683.8。肛交。计算的。对于C₄₅H₅₃N₅O₆年代₂:C, 65.59;H, 6.48;8.50 N,发现:C, 65.48;H, 6.42;8.61 N,。

(2,6-Bis (4) - 10-bromodec-1-ynyl 1 h-pyrazol-1-yl)吡啶 ( 5) 。悬浮溶液的化合物 4(0.20克,0.242更易)在干燥的丙酮溴化锂(0.0842克,0.970更易)补充道。在RT 2 h后搅拌,丙酮是蒸发减少压力和redispersed水和原油化合物提取与扩张型心肌病。DCM的蒸发后,复合 5得到白色固体(89%的收益率)。¹核磁共振(400 MHz, CDCl₃): δ= 8.5 (2 h), 7.9 (m, 1 h), 7.8 (d, 2 h), 7.7 (s, 2小时),3.4 (m, 2 h, -BrCH₂),2.4 (m, 4 h), 1.9 (m, 4 h), 1.5 (m, 4 h), 1.4 (m, 8 h), 1.3 ppm (m, 8 h)。¹³理化性质(100 MHz, CDCl₃): δ= 149.4,144.6,141.5,129.0,109.5,106.5,92.5,70.7,34.0,32.7,28.9,28.8,26.4,19.4 ppm。傅立叶变换红外光谱(KBr): 3437, 2924, 2854, 1720, 1651, 1599, 1481, 1390, 1101, 1014, 954, 800。质分析 m / z:实验值= 502,计算值= 501.2。肛交。计算的。对于C_31日H₃₉Br₂N₅:C, 58.04;H, 6.13;10.92 N,发现:C, 58.12;H, 6.17;24.87 N,。

N, N′ - (1,1′ - (10、10′ - (1,1′ ——(Pyridine-2 6-diyl) bis (1 h-pyrazole-4 1-diyl)) bis (dec-9-yne-10 1-diyl)) bis diacetamide (2-oxo-1, 2-dihydropyrimidine-4 1-diyl)) ( 1) 。N4-acetyl胞嘧啶(0.333克,1.404更易)在干燥DMF(15毫升)摄于100毫升圆底烧瓶。K₂有限公司₃(0.258克,1.814更易)添加到该解决方案将n -乙酰胞嘧啶转换成盐。在室温下搅拌约15分钟后,化合物 5(0.3克,0.468更易)添加和加热回流16 h在80°C。DMF被减压和原油产品下redispersed水和氯仿提取。有机部分盐酸洗了0.1(20毫升)和饱和氯化钠溶液(10毫升)。复合 1蒸发后得到氯仿以液态形式,采用硅胶柱层析法纯化以5%甲醇/ DCM。纯化合物 1得到白色固体与55%的收益率。¹核磁共振(400 MHz, CDCl₃): δ= 10.4 (nh), 8.5 (s, 2小时),7.9 (m, 1 h), 7.8 (d, 2 h), 7.7 (s, 2小时),7.6 (d, 1 h), 7.4 (d, 1 h), 3.8 (m, 2 h, -NCH₂),2.4 (m, 4 h), 2.3(年代,6 h), 1.7 (m, 4 h), 1.5 (m, 4 h), 1.4 ppm (m, 16 h)。¹³理化性质(100 MHz, CDCl₃): δ= 171.3,162.8,155.7,149.4,148.8,144.6,141.5,129.0,109.5,106.9,96.7,92.5,70.6,51.1,36.5,31.4,29.7,28.9,26.4,24.8,21.2,19.4 ppm。傅立叶变换红外光谱(KBr): 3325, 3136, 2926, 2852, 1697, 1662, 1556, 1479, 1429, 1381, 1307, 1219, 1178, 1028, 952, 866, 800, 655, 617。质分析 m / z:实验值= 646.0,计算值= 645.2。肛交。计算的。对于C₄₃H₅₁N₁₁O₄:C, 65.71;H, 6.54;19.60 N,发现:C, 65.86;H, 6.51;19.51 N,。

合成Nanovesicles稳定的peg - 400。复合 10.00063(0.5毫克,更易)溶解在0.5毫升的DMSO和快速注射在50毫升的去离子水的剧烈搅拌,包含predissolved peg - 400(0.6克,0.0003更易)。在RT 5分钟的搅拌后,解决方案是降低铸型硅和TEM分析了AFM和台光谱。剩余的解决方案是在温和搅拌在RT 120 h,和样本收集和分析每24 h。

合成Nanovesicles稳定的peg - 2000。实验进行如上所述;peg - 2000是用来代替peg - 400。

合成TFN-Loaded稳定Nanovesicles。股票的解决方案terfenadine (TFN的)是由溶解2毫克的TFN的1毫升的去离子水。 10.00063(0.5毫克,更易)溶解在0.45毫升的DMSO,混合着0.05毫升TFN的股票的解决方案,并迅速注入在50毫升的去离子水的剧烈搅拌,包含predissolved peg - 2000(0.6克,0.0003更易)。12 h RT的搅拌后过滤解决方案是通过与亲水性的注射器注射器过滤器(微孔、气孔大小0.45 μm,亲水性PVDF)去除过多的TFN的peg - 2000然后囊泡与去离子水清洗和最终成交量调整至10毫升(解决方案V1-TFN)。这个解决方案是用来识别TFN的浓度在囊泡,药物微囊泡的稳定性和斑马鱼研究。参见实验的示意图表示(数字 2和 3)。

尺寸和形貌的纳米结构进行扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和透射电子显微镜(TEM)。使用飞利浦XL30扫描电镜研究进行整体扫描电子显微镜与梁20千伏的电压。对测量进行日立s - 4500 SE / N在20 kV仪器操作。范TEM研究使用Tecnai G2 F12透射电子显微镜(TEM)的加速电压200 kV。碳涂层TEM网格(200目b)从TED斗篷INC .)购买美国。原子力显微镜(AFM)成像进行NT-MDT模型解算器Pro M显微镜使用一个类2 r 650纳米的激光波长的最大输出1 mW。计算和图像处理都是由一个软件新星1.0.26.1443由制造商提供。这些照片是记录在一个semicontact模式使用无触点超级锋利的硅悬臂(NSG 10 _dlc)之类钻碳(DLC)提示从NT-MDT购买,莫斯科。的维数提示如下:悬臂长度= 100 (±5) μ米,悬臂宽度35 (±5) μ-2.3 m,悬臂厚度= 1.7 μm;共振频率= 190 - 325千赫;力常数= 5.5 - -22.5 N / m;芯片尺寸= 3.6×1.6×0.4毫米;反射端=盟;提示高= 10 - 20 μm;DLC尖端曲率半径= 1 - 3海里。

AFM、LCFM、SEM、FESEM和TEM-Samples准备。样品溶液的两滴下降(在干净的载玻片AFM研究毛细管。样品溶液的两滴下降(碳包覆铜网格(200目)和不同的时间间隔的TEM研究纳米结构。

药物微囊泡的稳定性研究。解决方案V1-TFN了在温和搅拌RT 120 h,每24 h和样本收集和分析来确定时间点nanovesicles瓦解何时开始。

浓度的测定TFN的在周围媒体(图 3)。TFN的浓度在溶液中产生的泄漏从nanovesicles调查后在不同的时间点过程描述如下:1毫升的解决方案V1-TFN收集,亲水性注射器过滤器,过滤和清洗1与1毫升的去离子水。用二异丙醚TFN的提取从滤液;溶剂蒸发,剩下TFN的再溶解在乙腈2毫升。TFN的浓度在这个解决方案中公布的修改显示测量过程( 15, 16]。TFN的解决方案在乙腈(2毫升)和2毫升DDQ解决方案(5毫克/毫升)。彩色物种生成和吸收强度测量立即在457海里,与校准图形相比,这是由策划CT形成复合物的吸光度与药物的最终浓度( μg / mL)。本研究对收集到的样本重复每24 h 120 h。

浓度的测定TFN的内部Nanovesicles(图 3)。TFN的浓度在囊泡在不同时间点进行了以下程序下面描述:1毫升的解决方案V1-TFN收集,亲水性注射器过滤器,过滤和清洗时间和1毫升的去离子水去除多余的药物和peg - 2000和残渣redispersed 2毫升的水和受到声波降解法对30分钟RT打破所有的囊泡和释放TFN的。超声波诱导本地化的能力,从脂质体药物控制释放,多聚体合成diblock共聚物,是众所周知的现象( 17, 18]。接下来,TFN的从这个解决方案中提取了大量二异丙醚;溶剂蒸发,剩下TFN的再溶解在乙腈2毫升。更换溶剂与ACN是必要的,因为它显示超级优先于其他溶剂CT复杂的形成,同时促进电荷转移从供体受体。吸光度TFN的强度在ACN当时测量解决方案选择吸收最大(457海里)和所获得的值与值的校准曲线获得使用TFN的解决方案:DDQ复杂的已知浓度的(参见数据 9和 10)。TFN的计算应用比尔-朗伯定律的浓度为37.5 μM,这允许我们发现药物装载效率使用以下方程: (1) 加载 效率 = C 1 C 0 × One hundred. % , 在哪里 C 0 是一个TFN的初始浓度的解决方案,而 C 1 在加载后囊泡TFN的浓度。本研究对收集到的样本重复每24 h 120 h。

斑马鱼致畸性评估。斑马鱼维护、繁殖和胚胎收集是由前面描述的方法( 19, 20.]。短暂,野生成年斑马鱼(5 - 6个月)保持在28°C下14:10 h光明与黑暗周期。鱼被允许品种(3比2的女性:男性)在早晨的刺激下光。胚胎收集到petridish含有胚胎中、在28°C的环境温度。致畸性的研究是使用6执行胚胎孵化与车辆,积极控制,以及各种测试化合物的浓度 1直到 5dpf。胚胎被麻醉使用三卡因0.008%解决方案和各种表型参数进行评估;即体型、体节、脊索、尾巴,肠,鳍,大脑,上颌,心,下颚,肝脏和鱼鳔观察缺陷的形态( 21]。每个胚胎的得分是基于他们的毒性水平从5无毒和0.5剧毒。得分是由盲观察员和做是根据前面描述的过程 22]。

协议斑马鱼治疗TFN-Loaded Nanovesicles。TFN-NV评估3 dpf(受精后的天数)幼虫分布在24-well板连同250 μL 0.1% DMSO溶液。每个包含6胚胎与各种治疗和观察幼虫在24小时的时间点,48 h, 72 h。胚胎被处理不同浓度的TFN的加载微泡(5 μ10米, μ米,20 μM, 40 μ20米)。TFN的独自住在 μM浓度被用作积极控制和0.1% DMSO作为消极控制。胚胎孵化在24-well板和心房和心室率在不同的时间点观察治疗后。所有观察胚胎死亡率产生TFN的效果。斑马鱼胚胎毒性研究的结果总结在表 1。

分子 1合成了六个步骤从BPP(计划 1)。碘化的4,4′′BPP合成的位置 2是按我们的报告程序 13, 14]。“链接器分子”decyn-1-ol的附件 2是通过采用Sonogashira交叉耦合条件得到了什么 3良好的收益率(80%)。复合 3在DCM溶剂甲苯磺酸盐的三乙基胺基给4 75%的收益率。复合 5是在优秀的收益率(89%),在治疗吗 4在室温下与LiBr丙酮。目标bolaamphiphile 1包含水溶性结束组连接到一个疏水烷基链中得到55%的收益率,治疗 5与N4-acetyl胞嘧啶在碳酸钾存在80°C。温度变量¹核磁共振的研究 1在CDCl₃表现出明显的胞嘧啶的油田化学位移nh -组在减少温度(补充信息图网上S1 http://dx.doi.org/10.1155/2014/369139)。这个观察表明H键操作分子间相互作用的胞嘧啶。此外,DMF溶液缓慢加入水(10⁻³米)的 1表现出明显的蓝移在紫外滴定表明其J-aggregation行为。

研究聚合驱动的纳米结构的形成,一个解决方案包含2毫克的化合物 1在DMF(12毫升)/水(6毫升)准备和稳定一小时。降低铸造这个解决方案在二氧化硅其次是SEM分析显示清楚的几微米长纤维网络的形成(图 4)。为了揭开nanofibrous网络组件的生成机制,相同的解决方案 1是立即下降(不稳定碳涂层TEM网格。有趣的是,TEM显微图显示的存在微小的囊泡的大小~ 200纳米(图的范围 5(一个))和一些聚合珠链与囊泡的大小~ 150纳米(图的范围 5 (b))。另外1 d的生成珍珠连锁组装形成的囊泡的融合表明nanotubular网络数据 5 (c)和 5 (d))。进一步验证球形囊泡的融合在二氧化硅纳米管表面AFM研究。AFM地形清楚地揭示了存在nanovesicles (NVs) ~ 200纳米的大小(数字 6(一)和 6(b))。有趣的是,一些样本显示,自发形成的珠链像水泡总成或纳米管集成的囊泡,指出囊泡融合。每1 μ链长ca。5发现囊泡融合,与囊泡的平均直径匹配(数字 6(c)和 6(d))。连续AFM测量显示光滑nanotubular结构的进化~ 160 nm直径的珠链像水泡总成由于分子重组(数字 6(e)和 6(f))。最后形成管直径小于初始(~ 160海里)泡直径一个孤立的囊泡(~ 200海里)由于拉伸的囊泡融合在一维管形成。管的直径是由表面张力之间的平衡和管弯曲刚度,防止膜崩溃。管的外表面非常光滑,粗糙度比< 1 nm(小数字 6(g)和 6(h))。这个结果证明了柔性的本质提出了合成膜组成的 1。纳米管的另一个有趣的发现是他们倾向于通过自组织形成各种类型的network-junctions(图 6(e)、插入)。

演示应用程序的神药,在第一步中,不同条件下筛选稳定囊泡在溶液状态,防止管状结构的形成。我们打算用聚乙二醇(PEG)为稳定剂,因为它是生物中立而且适用于制药应用[fda生物相容性的聚合物 23]。peg - 400和- 2000是用于稳定nanovesicles挂钩。在一个典型的过程DMSO溶液的化合物 1在0.5毫升(0.5毫克)是迅速注入包含挂钩的去离子水在50毫升(0.6 g)在剧烈搅拌5分钟在rt NVs与聚合物分子量较低的聚乙二醇(PEG - 400)没有演示高稳定性;然而使用peg - 2000稳定囊泡108 h。甚至在那个时间点保留大量的囊泡结构,虽然他们的表面并不光滑,因为它在24和48小时。神的大小分布的范围是在< 60 nm 130海里;一个微不足道的大囊泡(~ 250 nm)也观察到(数字 7(一)和 7 (b))。

NVs基础药研究斑马鱼被选为模式生物,因为它很容易维护,相对便宜的,给了立竿见影的效果,是一个很好的预测疗效和安全性的化学物质( 24, 25]。为了探索毒性化合物 1斑马鱼致畸性试验。受精后治疗24高通滤波器(小时)胚胎的解决方案 1在不同浓度和研究他们的成长和发展没有异常(图5天 8和表 1)。图 5代表所有参数不同的治疗组病变评分的平均值。这个实验证实了无毒的特性 1在测试浓度。

在药物输送研究中,一个众所周知的抗组织胺药物terfenadine (TFN的)被选为模型药物。TFN的也是影响斑马鱼的心跳规律,导致心动过缓、房室堵塞,最终死在不到12个小时( 26]。选择这种药物有助于容易监测的影响斑马鱼通过观察端点的死亡率在治疗后不同时间点。无毒的本质 1在斑马鱼致畸性试验已经进行测试,任何斑马鱼死亡率只有归因于TFN的的影响。此外,这个过程很简单,快速,无创检测药物作用的方法。准备drug-encapsulated nanovesicles, TFN的化合物 1在溶液中迅速溶解在DMSO和注射的peg - 2000的水搅拌。的drug-encapsulated nanovesicles解决方案是留给12 h老化,合成解决方案是subsecuently受到研究TFN-loading效率和nanovesicles稳定。

TFN的测定生物样品中的浓度是一个具有挑战性的分析任务。简单的应用光谱方法(例如,测量紫外吸收和荧光发射强度)不适用,因为没有获得值之间的相关性和药物的内容。当前报道的大多数方法(例如,高效液相色谱法或NMR)缺乏敏感度测量药物浓度低于10水平 μ克/毫升( 15, 16]。因此基于电荷转移分光光度测定方法(CT)反应的TFN的2,3-dichloro-5, 6-dicyano-1, 4-benzoquinone (DDQ)选择( 15]。这种技术是一种最简单、快速、准确的方法发展到现在。在这种方法中,TFN的充当n电子供体形成一个高度的电荷转移(CT)复杂的自发反应 π 受体DDQ。为了实现这个过程,找出初始浓度的药物加载在囊泡,我们开发了一个内部协议(数字 3, 9, 10)。使用这种方法,计算药物装载效率到囊泡~ 35±1%。进一步,为了证明没有药物泄漏从囊泡周围媒体随着时间的推移,我们进行稳定控制实验:药物微囊泡在RT 120 h,轻轻地搅拌收集样本每24 h和检测浓度TFN的内囊泡和母液(解决方案收集声波降解法之前)在每一个时间点,描述图 3。实验显示,没有主要渗漏观测72 h(图 11)和浓度TFN的媒体仍低于10 μ米,斑马鱼灵敏度阈值(鱼开发和心跳不低于这个浓度TFN的影响)。随后,观察药物破裂释放72 h后,当母液中TFN的浓度突然增加,越过10 μm .同时TFN的浓度在72 h后NVs急剧减少。我们假设缓慢溶解涂料挂钩导致变形NVs和突然的药物释放(图 6卡通)。这些数据关联与TEM数据记录在不同的时间点对囊泡。数据 12(一个)和 12 (b)代表的TEM图像囊泡在24和72 h,分别。在24 h NVs具有良好定义的形状(图 12(一个)),而在72 h,我们观察NVs和减少NVs退化(图 12 (b))。这也很好的说明了药物破裂释放72 h后,影响常见的nano - /微球或纳米/微泡系统( 27, 28]。

斑马鱼幼体服用TFN-loaded nanovesicles (TFN-NV)在四个不同的浓度(5 μ10米, μ米,20 μM, 40 μTFN的M)和观察的时间点24 h, 48 h, h和72年调查后造成的死亡率TFN的药物治疗(图 13)。20 TFN的单独的浓度 μM作为积极的控制。观察结果表明,幼虫在积极控制(TFN的孤独,20 μ在12 h M)去世。幼虫TFN-NV暴露在低浓度(5 - 10 μ米)第一个病例死亡率(因此药效)观察到24小时在48小时内,所有的鱼死亡。进一步拉长效果观察到20 μM;死亡率逐渐增加从24小时和完整的死亡率只发现了72 h。

没有死亡病例观察幼虫治疗药物浓度最高的48 h,但他们都是死在72 h的时间点。这种畸变的解释在最高浓度可以基于这一事实的TFN-NV 40 μ形成聚合(图 14),因此可能不进入体循环斑马鱼;然而到了72小时TFN-NV会释放所有TFN的导致晚期死亡率。囊泡稳定性研究和TEM数据(数据 11, 12, 14)支持这个解释。除此之外,我们观察到沉淀的nanovesicles 40 μ解决方案如果不加以干涉。延迟死亡率在其他浓度暗示持续/延迟释放从TFN-NV TFN的体内,可控制通过改变nanovesicles的浓度。当我们没有观察药物的主要泄漏从nanovesicles 72 h(母液中药物的浓度低于斑马鱼灵敏度阈值),我们得出这样的结论:影响TFN的低于72 h是观察药物释放之后才在斑马鱼有机体。