IJI 国际期刊炎症 2042-0099 2090-8040 Hindawi 10.1155 /三百九十八万〇五百〇七分之二千〇二十○ 3980507 研究论文 JNK信号通路通过上调NGAL抑制lps介导的HK-2细胞凋亡 https://orcid.org/0000-0003-2202-6618 韩 梅 1 泛 玉霞 2 高 Mengying 1 张 俊丽 1 王 风扇 1 Slomiany 文学士 1 急诊科 河北医科大学第二医院 石家庄 中国 hebmu.edu.cn 2 血液病科 河北医科大学第二医院 石家庄 中国 hebmu.edu.cn 2020 24 4 2020 2020 31 10 2019 19 03 2020 08 04 2020 24 4 2020 2020 版权所有©2020韩梅等。 这是知识共享署名许可，允许在任何媒体不受限制地使用，分发和复制下发布的开放式访问文章，提供原工作正确引用。

目的。探讨c-Jun n末端激酶(JNK)信号通路在NGAL表达上调中的作用及其在脂多糖(LPS)介导的肾小管上皮细胞损伤中的抗凋亡机制。 方法。In vitro, HK-2 cells were divided into five groups (Con, LPS 1 h, LPS 3 h, LPS 6 h, and LPS 12 h groups) based on the time of LPS (10  μM）治疗。NGAL和caspase-3基因的表达水平通过RT-PCR检测，以评估动态变化。HK-2细胞与SP600125预处理（20  μM）2小时，随后LPS（10  μM）刺激3小时。NGAL和caspase-3基因表达水平然后测定。 结果。NGAL mRNA的6小时内显著增加，和caspase-3的mRNA在3小时内治疗后（增加的 P < 0.05 )。相关分析表明（它们的表达之间的相关性高 [R = 0.448, P < 0.05 )。与SP600125预处理后，LPS组中NGAL mRNA的表达受到抑制，而胱天蛋白酶-3的混合物显著增加。The NGAL mRNA expression level in the SB + LPS group was decreased significantly compared with that in the LPS group, but it was slightly higher than that in the SP group (∼1.5 times of that in the Con group). However, caspase-3 mRNA expression was increased significantly in the SB + LPS group ( P < 0.001 ）（在Con组中的该3.5倍）。它还与SP和LPS组相比，表现出显著上升（ P < 0.001 与某人组; P < 0.05 与LPS组）。We also found that NGAL and caspase 3 proteins were increased significantly in LPS and SP + LPS groups, but SP600125 decreased the NGAL level by almost 35% and increased the caspase 3 level by 50% in the SP + LPS group compared with the LPS group ( P < 0.05 )。 结论。通过上调NGAL的JNK信号传导途径抑制LPS介导的肾小管上皮细胞的凋亡。

 河北省重点研究发展计划 172777161 重点项目为河北省医学科研 20170548 1.简介

中性粒细胞明胶相关脂质运载蛋白（NGAL）是在正常生理条件下非常低的水平表达的多功能蛋白质。然而，当主体被破坏，其在肾，结肠，肝和肺的增加上皮细胞中的表达显着[ 1]。我们先前的研究发现，当HK-2细胞用脂多糖（LPS），刺激的NGAL mRNA表达上调显著其中胱天蛋白酶-3在细胞的显着抑制上调，从而减少损伤的细胞凋亡[ 2]。作为一种急性期蛋白，NGAL可以抑制损伤，保护上皮细胞。然而，通过该NGAL的表达在败血症期间在肾小管细胞中上调的机制尚不清楚。在我们目前的研究，LPS用于刺激HK-2细胞，从正常肾衍生的近端小管细胞系，并观察在NGAL mRNA表达和caspase-3的变化。此外，JNK-特异性抑制剂SP600125被用来预处理HK-2细胞，以观察对细胞凋亡的关键酶上调的NGAL的效果，并鉴定参与期间上调NGAL的信号通路LPS介导的肾上皮细胞的损伤和可能的角色。

 2.材料和方法 2.1。物料

永生化人近端肾小管上皮细胞株HK-2从Bioleaf（上海，中国）。包括其它试剂 大肠杆菌脂多糖（大肠杆菌O111B4;西格玛，MO，USA），特级胎牛血清（PAA，奥地利），DMEM（GIBCO，USA），JNK途径抑制剂SP600125（塞莱克，USA），PrimeScript RT™试剂试剂盒（Takara，日本）和Power SYBR绿色PCR主混合物（宝，日本）。在培养物上清液中NGAL蛋白通过测量酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（R＆d系统;明尼阿波利斯，MN，USA）。一级抗体是抗蛋白酶3（Santa Cruz公司，USA）兔单克隆抗体和 β肌动蛋白（Sigma）中。

 2.2。引物序列

引物PubMed中GenBank中搜寻如表 1。引物由Invitrogen(美国)合成。

用于RT-PCR的引物。

基因 顺序 产品（BP）
NGAL TTGGGACAGGGAAGACGA 240
TCACGCTGGGCAACATTA
胱天蛋白酶3 GTTCATCCAGTCGCTTTGTGC 110
AAATTCTGTTGCCACCTTTCG
GAPDH TCGCGGGAGACCACCGACAC 258
GGGGTGTTGGGTCAGGTCTCTG
2.3。实验方法 2.3.1。细胞培养

HK-2 cells were seeded at 5 × 107per T25 flask containing D-MEM/F12 medium with 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, and 100 U/ml streptomycin and cultured at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO2。冷冻保存，按常规进行心肺复苏，以及细胞传代。

 2.3.2。LPS处理后NGAL和Caspase-3 mRNA表达的测定

HK-2 cells were seeded in a six-well plate at 5 × 10五细胞每口井。培养12小时后，分为5组，对照组(Con)和4个LPS处理组(LPS 1 h、LPS 3 h、LPS 6 h、LPS 12 h) μM代表1,3，6和12小时，分别LPS。重复测量三次，每个组。在每个时间点，在培养板中的培养基弃去，将板用PBS洗涤一次。Then, 1 ml of precooled Trizol was added, followed by agitation. The cell suspension in each well was collected in EP tubes and stored at −80°C to detect mRNA expression of NGAL and caspase 3.

 2.3.3。SP600125预处理后NGAL和Caspase-3 mRNA表达及蛋白分泌测定

HK-2细胞（1）培养和处理。HK-2 cells were seeded in a 6-well plate at 2 × 10五每孔培养细胞，在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中不加抗生素培养24小时。

细胞分为4组:对照组、LPS组、SP组和SP + LPS组。每组在三口井中重复三次。每组重复测量3次。SP600125 (20 μmol/L) was added to the medium in SP and SP + LPS groups, and the cells were cultured for 2 hours. Subsequently, the culture medium was replaced with serum-free DMEM/F12 medium for Con and SP groups or D-MEM/F12 medium containing 10  μM LPS for LPS and SP + LPS groups, and the cultures were continued for another 3 hours.

的时间点达到后，在培养板中的培养基弃去，平板用PBS洗一次。Then, 1 ml of Trizol was added, followed by agitation. The cell suspension in each well was collected in EP tubes and stored at −80°C to detect mRNA expression of NGAL and caspase 3.

（2）定量实时聚合酶链反应（定量RT-PCR）。从平板中收集HK-2细胞在Trizol试剂溶解在冰上。细胞RNA提取后，将其分析使用Nanodrop ND-1000分光光度计（使用Nanodrop技术，威尔明顿，DE）的纯度。使用逆转录试剂盒得到的cDNA，和2  μ升的cDNA用于PCR扩增。PCR was performed under the following conditions: predenaturation at 95°C for 30 s, followed by denaturation at 95°C for 5 s, and annealing at 60°C for 34 s. The amplification was performed for 40 cycles. β-Actin作为内参基因。相对基因表达分析的ΔΔCt方法的看家基因GAPDH内部控制。

（3）ELISA。HK-2细胞用LPS处理，SP600125，如上所述，然后收集培养上清液。NGAL在培养上清液中的浓度使用ELISA试剂盒测定，根据制造商的说明。

（4）蛋白质印迹法。总蛋白从细胞裂解物根据标准方法提取。蛋白的等量进行10％SDS-PAGE，然后转移到已与一抗一起温育对胱天蛋白酶3和硝酸纤维素膜 β肌动蛋白过夜，接着通过二次山羊抗兔抗体。最后，Western印迹进行扫描，并使用进行半定量分析 β-肌动蛋白作为蛋白质负荷的对照。每个实验至少重复三次。

 2.4。统计分析

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。Data are expressed as the mean ± standard deviation ( X ¯ ± SD )。每组中测试的正态后，用于将LSD方法比较单因子变异数分析。 P < 0.05 被视为统计学显著。

 3.结果 3.1。HK-2细胞的内毒素刺激影响NGAL表达与细胞凋亡

如通过qRT-PCR测量，后HK-2细胞用10处理  μM LPS、NGAL mRNA表达在刺激后6h内显著升高，LPS 1h、LPS 3h、LPS 6h组与Con组相比差异显著(LPS 1h、3h组与Con组相比， P < 0.001 ;lps6h组vs Con组， P < 0.01 )。在LPS处理后12小时，NGAL mRNA表达恢复到基线水平，示出了与Con组相比无差异显著（ P > 0.05 )。LPS 3 h组HK-2细胞NGAL mRNA表达峰值是基线水平的2.856±0.389倍。将HK-2细胞用10 μ与Con组相比，LPS 1 h和LPS 3 h组caspase mRNA表达差异显著(LPS 1 h组vs Con组， P < 0.001 ;lps3h组vs Con组， P < 0.01 )。At 6 hours after LPS treatment, mRNA expression of caspase 3 returned to the baseline level, and caspase-3 mRNA expression in LPS 6 h and LPS 12 h groups showed no significant difference compared with the Con group ( P > 0.05 )。LPS 1 h组HK-2细胞中caspase-3 mRNA表达峰值较基线升高3.029±0.448倍。相关分析显示NGAL与caspase-3 mRNA表达高度相关( [R = 0.448, P < 0.05 )(图 1)。

在LPS处理的HK-2细胞的NGAL表达和胱天蛋白酶3倍的mRNA。数据为平均值±标准差三个独立的实验重复进行。有在1小时2.0倍的增加在NGAL mRNA表达10后  μM LPS处理，10小时后3小时增加到2.8倍 μ在LPS处理后3小时中号LPS治疗后降低至1.6倍。 * * P < 0.01 和 * * * P < 0.001 相对于对照组。有在1小时3.02倍的增加在caspase-3的mRNA表达10后 μ中号LPS处理，降低到3小时10后1.4倍  μ中号LPS处理。 ＃ ＃ P < 0.01 和 ＃ ＃ ＃ P < 0.001 相对于对照组。

 3.2。内毒素刺激HK-2细胞影响SP600125预处理后NGAL表达和细胞凋亡

与SP600125，在NGAL mRNA表达的预处理后LPS刺激的HK-2细胞受到抑制，而胱天蛋白酶-3的mRNA表达显著增加。LPS组NGAL mRNA表达显著增加（ P < 0.001 ）由2.0 Con组中的该次。另外，胱天蛋白酶-3 mRNA表达显著上调（ P < 0.01 ）由2.8 Con组中的该次。SP组NGAL mRNA表达显著抑制（ P < 0.01 ）将Con组中的41％。然而，与Con组相比caspase-3的mRNA表达表明没有显著变化（ P > 0.05 。The NGAL mRNA expression level in the SB + LPS group was decreased significantly compared with that in the LPS group, but it was slightly higher than that in the SP group (∼1.5 times of that in the Con group). However, caspase-3 mRNA expression was increased significantly in the SB + LPS group ( P < 0.001 ）由3.5 Con组中的该次。它还与SP和LPS组相比，表现出显著上升（ P < 0.001 与某人组; P < 0.05 与LPS组）（图 2)。我们还确定NGAL的浓度和HK-2细胞培养上清和caspase 3个的蛋白。Increased levels of NGAL and caspase 3 were observed in LPS and SP + LPS groups, but SP600125 decreased the NGAL level in the SP + LPS group by almost 35% compared with the LPS group ( P < 0.05 ，图 3），并通过在50％左右的增加胱天蛋白酶3级（ P < 0.05 ，图 4)。这些观察结果表明JNK涉及LPS诱导的NGAL表达及细胞凋亡HK-2细胞的。

的mRNA在SP600125预处理后LPS处理的HK-2细胞和caspase-3 NGAL的表达。数据为平均值±标准差三个独立的实验重复进行。 * * P < 0.01 和 * * * P < 0.001 相对于NGAL mRNA的对照组。 ＃ ＃ P < 0.01 和 ＃ ＃ ＃ P < 0.001 相对于胱天蛋白酶-3的mRNA对照组。

JNK抑制剂SP600125（20  μM）减弱HK-2细胞LPS诱导的NGAL蛋白分泌。数据为平均值±标准差三个独立的实验重复进行。 * * P < 0.01 和 * * * P < 0.001 相对于对照组。

JNK抑制剂SP600125（20  μM)增加脂多糖诱导的caspase 3蛋白在HK-2细胞中的表达。(a) caspase 3蛋白的Western blot检测。(b) caspase 3蛋白水平的定量。 β-Actin作为内部对照。数据为平均值±标准差三个独立的实验重复进行。 * * P < 0.01 和 * * * P < 0.001 相对于对照组。

 4。讨论

NGAL被Kjeklsen等人发现的。[ 3， 4] in 1993 during a study on matrix metalloproteinase 9 (also known as 92 kDa gelatinase). Subsequently, a series of studies have demonstrated that NGAL is a good biomarker for early diagnosis of acute kidney injury (AKI) [ 五]。然而，NGAL作为肾损伤过程中上皮细胞的急性期蛋白的生物学作用尚不清楚。米什拉等。应用外源性NGAL缺血性AKI大鼠模型，并发现它保护的肾小管上皮细胞，减轻缺血再灌注损伤，抑制和凋亡损伤后[ 6]。然而，很少有研究探讨脓毒症AKI及其相关机制过程中保护肾脏NGAL的作用。在我们以前的体外研究[ 2，凋亡是脂多糖介导的HK-2细胞损伤的主要病理特征。及时上调受损肾小管上皮细胞NGAL基因表达，可抑制caspase-3基因的上调，从而抑制细胞凋亡，减轻细胞损伤。然而，调节NGAL的信号通路尚不清楚。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，其激活Toll样在肾小管上皮细胞受体4。它还通过NF-诱导各种炎性细胞因子和趋化因子的表达 κB途径，导致AKI，并通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族介导炎症损伤[ 7]。MAPK作为一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号转导系统，是细胞中重要的跨膜信号通路。它有四个家庭成员:细胞外signal-regulated激酶(ERK),压力激发了蛋白激酶物(物),p38 MAPK和ERK5 [ 8]。最近的研究已经发现，JNK的活化上调的核心炎性因子，如TNF-α合成 αIL-6和IL-1 β，内毒素休克的大鼠模型，并促进炎症因子和进一步活化JNK，由此扩增的内毒素诱导的损伤。所述JNK / MAPK信号传导途径的抑制显著降低了死亡率的败血症[ 9， 10]。本研究中使用的SP600125是JNK/MAPK信号通路的特异性抑制剂。它通过与JNK竞争atp结合位点来抑制激酶。在我们的研究中，我们用SP100125抑制JNK通路(20) μM），随后LPS刺激。接下来，我们观察到的NGAL和变化HK-2细胞的胱天蛋白酶-3表达调查JNK途径在NGAL对肾小管上皮细胞损伤的抑制效果的作用。结果证实，SP600125通过阻断JNK途径抑制NGAL在LPS损伤后HK-2细胞的上调。这个结果类似于今野等人的研究。谁表明，NGAL mRNA的表达，下调SP600125（10  μM）在IL-1 β诱导的犬肾小管细胞[ 11]。此外，活化细胞凋亡的关键酶之一caspase-3表达增加，说明lps处理的肾小管上皮细胞可促进细胞凋亡。提示通过JNK信号通路调控肾内NGAL表达，可抑制细胞凋亡，减轻内毒素引起的肾损伤，可能是治疗脓毒症相关急性肾损伤的新途径。

 数据可用性

在这项研究中产生的或分析所有的数据都包括在项目之内。

 伦理审批

所有实验均经河北医科大学动物使用与保护委员会批准。

 利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

 作者的贡献

MH进行的实验和数据分析，参与研究设计，并起草了手稿。ZLZ和FW概念化和设计研究和监督工作。MYG和YXP为研究提供智力投入，并与稿件的修订帮助。所有作者阅读并认可的终稿。所有作者同等贡献的手稿和批准的最终版本。

 致谢

感谢Edanz集团(中国)的Mitchell Arico ( http://www.liwenbianji.cn/ac），编辑这篇稿子的草案的英文文本。这项工作是由河北省医学科学研究所（批准号20170548），河北省（批准号172777161）和重点项目的主要研究发展计划的支持。

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