GRP 胃肠病学研究和实践 1687 - 630 x 1687 - 6121 Hindawi出版公司 585674年 10.1155 / 2012/585674 585674年 临床研究 微环境因素参与胰腺癌肿瘤的发展 Gardian Katarzyna 1 Janczewska Sława 1 Durlik Marek 1、2 Rydzewska Grazyna 1 外科学系研究和Transplantology 波兰科学院Mossakowski医学研究中心 5 Pawinskiego街,02 - 106华沙 波兰 2 胃肠病学和Transplantology手术 中央临床医院的内部事务在华沙 波兰 2012年 13 12 2012年 2012年 29日 06 2012年 22 11 2012年 2012年 版权©2012 Katarzyna Gardian et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

介绍。尽管密集的研究在许多年里,胰腺腺癌仍是最致命的癌症之一。手术治疗仍是主要治疗的可能性,因为化疗和放疗对长期生存的影响很小。我们仍在寻找这种毁灭性疾病的弱点。 材料和方法。从36例胰腺肿瘤组织样本收集。免疫组织化学染色法被用来评估生长因子的表达和免疫浸润。活动评估MMP2和MMP9的明胶zymography 7.5% sds - page凝胶凝胶为0.1%。 结果。生长因子都强烈表达胰腺肿瘤组织。我们发现c-Met受体的表达水平是G2 G3肿瘤高于肿瘤。我们也发现,活跃MMP2出席所有阶段的肿瘤而活跃MMP9在更先进的肿瘤。丰富的免疫细胞浸润是独特的肿瘤组织,特别是巨噬细胞浸润肿瘤组织。我们发现大量的巨噬细胞与淋巴结转移有关。 结论。在我们的研究表明,在众多影响因素的肿瘤微环境c-Met受体,巨噬细胞浸润和MMP2产生重大影响胰腺癌的发展和入侵。

 1。背景

尽管密集的研究在许多年里,胰腺腺癌仍是最致命的癌症之一。手术治疗仍是主要治疗的可能性,因为化疗和放疗对长期生存的影响很小。研究在过去20年取得了深入的胰腺癌生物学,但改进的诊断方法和治疗的方法。我们仍在寻找这种毁灭性疾病的弱点。

近年来显示,肿瘤微环境在肿瘤进展中扮演着一个关键的角色 1]。在胰腺肿瘤微环境尤其异构。它由致密的纤维基质与癌症细胞,星状细胞、浸润炎症细胞,保持合适的胰腺的结构。这些细胞的来源各种生长因子以及proangiogenic因素。成纤维细胞存在于肿瘤的组织负责生产胶原蛋白、纤粘连蛋白的增加肿瘤的药物抗性。因为丰富的纤维组织,肿瘤环境强烈缺氧( 2, 3]。所有这些因素导致疾病的性质和发生的早期转移。

浸润炎症细胞的丰富来源因素影响肿瘤生长,入侵和转移。巨噬细胞是特别感兴趣的。他们在肿瘤中的作用近年来的环境研究( 4]。众所周知,他们arich生长因子的来源,像EGF刺激细胞增殖,PDGF-BB HGF α,TGF β 。此外他们还生产矩阵metalloproteinase-9 (MMP9)参加各种基本过程( 5]。

基质金属蛋白酶是一组20蛋白酶分为4个子类:胶原酶、明胶酶,stromelysins和膜式基质金属蛋白酶。他们参与细胞外基质的修改使血管生成等过程的重要组成部分,细胞迁移和转移的形成。他们也参与激活许多蛋白质,这样他们就能调节增殖和凋亡 6]。

MMP 2和9被归类为明胶酶。他们的角色转移形成具有重要意义,因为他们的基质胶原IV,基底膜的一个组成部分。其降解使癌细胞迁移成为可能。增加表达的MMP 2和9是在许多类型的癌症。在乳腺癌( 7他们的活动是与远处转移和食管与增加侵袭性癌的 8]。

也在胰腺癌中强烈表达基质金属蛋白酶的显示。在6细胞株,研究结果表明,增加表达和MMP2的活性与更大的侵入性胰腺癌细胞的潜力( 9]。

我们的研究的目的是调查三分可能影响肿瘤的发展:表达生长因子,炎症细胞浸润,基质金属蛋白酶的酶活性,从而有更完整的胰腺癌肿瘤。

 2。材料和方法 2.1。病人和样本采集

胰腺肿瘤组织样本收集来自36个病人因胰腺癌手术切除。组织收集基于协议华沙医科大学生物伦理学委员会批准。肿瘤分类根据TNM分期和肿瘤分级。PDAC病人之间的远程T1-T4 (T1 ( n = 3 )、T2 ( n = 6 )、T3 ( n = 25 )和T4 ( n = 2 N0)) ( n = 13 )、N1 ( n = 23 ),M0 ( n = 33 )和M1 ( n = 3 )阶段。还组织学分级评估:G1 ( n = 4 ),G2 ( n = 16 )和G3 ( n = 16 )。

样本对蛋白质分离、冷冻和储存在−20°C,直到他们被使用。免疫组织化学分析样品的尺寸 5 × 5 × 5 mm被冻结在丙酮为45秒使用干冰温度−−70°C和存储的80°C。

 2.2。凝胶Zymography

蛋白质分离出肿瘤组织使用总蛋白提取工具包(美国Billerica微孔)。10 μg总分离蛋白的酶谱的组织与两部分稀释样品缓冲(美国大力神Bio-Rad实验室)和解决7.5% sds - page含有0.1%明胶(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。电泳后,凝胶是用2.5% Triton x - 100删除SDS两次30分钟和孵化发展中缓冲区(50毫米pH值7.5和5毫米CaCl三羟甲基氨基甲烷缓冲液2和0.2 M氯化钠)20 h在37°C。白明胶酶活动被染色的凝胶可视化0.5% Comassie蓝色1 h其次是孵化使脱色溶液(40%甲醇,醋酸10%)。后来脱色凝胶和水冲洗。半定量的评价,凝胶的照片拍摄和缩微图像(日本奥林巴斯)软件使用。

 2.3。免疫组织化学

冷冻组织胰腺癌cryocut到5 μ米的部分。每个组织都沾hematoxylin-eosin ())。Dako真正想象探测系统,过氧化物酶/轻拍+,兔子/鼠标用于免疫染色。在室温下干燥后,幻灯片和丙酮固定10分钟。然后他们孵化5分钟双重内源性酶块(Dako、斯特鲁普、丹麦)。被孵化的部分用一个合适的抗体为25分钟EGF (Z-19)、表皮生长因子受体(EGF-R2) PDGF-BB (N-30), HGF α(h - 145), c-Met(技术)(所有圣克鲁斯生物技术形式,圣克鲁斯,美国)和CD68及CD3 (EBM11;F7.2.38、Dako斯特鲁普、丹麦)。后来孵化Dako真正想象/合,兔子/鼠标(ENV)在室温下25分钟之后,一个颜色反应使用Dako真正民建联+色原3分钟。幻灯片和迈耶的苏木精复染色。

 2.4。免疫组织化学染色的半定量分析

定量评价,5个地区选择在低功耗扫描肿瘤部分后40 x。这些字段在200 x放大使用缩微图像分析软件(奥林巴斯、日本),计算总脏的地方。

 2.5。统计分析

对两组进行比较:Mann-Whitney U 测试和与克鲁斯卡尔-沃利斯检验三组。被定义为最低级别的意义 P < 0.05 。

 3所示。结果 3.1。生长因子在胰腺癌

25肿瘤组织进行免疫组织化学表达生长因子在肿瘤组织(图 1)。表达生长因子被发现在所有情况下。表皮生长因子的免疫反应性弱到中度癌症细胞的细胞质中。至于EGFR我们发现其表情温和强在癌症细胞的细胞质和弱在小导管细胞。PDGF-BB免疫反应性是温和的癌症细胞的细胞质和6例我们发现癌细胞核染色以及免疫细胞浸润。膜和胞质染色HGF α是在肿瘤细胞而染色c-Met适度强劲。

生长因子的表达:(a) PDGF-BB癌巢,(b) PDGF-BB基质,(c) EGF、EGFR (d), (e) HGF α,(f) c-Met。原始的放大 × 200年。

生长因子的表达与肿瘤分级和N阶段相比。使用的半定量的估计认为是生长因子表达式,统计分析的结果表明,唯一的G2和G3集团之间的表达差异有统计学相关的c-Met受体( P = 0.033 )(图 2)。

比较表达生长因子综合数字网G2和G3肿瘤。

 3.2。浸润炎症细胞

评价细胞浸润我们使用单克隆抗体CD68、HLA II,中性粒细胞弹性蛋白酶,CD3、CD56。我们发现大量的淋巴细胞和巨噬细胞的渗透。也有强烈的中性粒细胞弹性蛋白酶的表达。没有观察到的NK细胞浸润。周围炎症细胞存在肿瘤腺体和还强烈周围神经肿瘤细胞(图所渗透 3)。

描述的炎性浸润(a)和(b) CD68巨噬细胞(c)和(d) CD3:原始的放大 × 200年。

我们比较结果由于N阶段,我们发现,肿瘤组织中巨噬细胞的数量明显高于组中与转移淋巴结比N0组(401)(167)( P = 0.0085 )(图 4)。

比较炎性浸润。

 3.3。凝胶Zymography

Genolytic活动在30胰腺肿瘤组织分离研究。活跃MMP2 (62 kDa)是存在于88%病例和MMP9在38%的情况下(83 kDa)。6个样品我们不能确定MMP的活动,因为模糊的照片凝胶。

比较结果显示为G1肿瘤组织学交易我们可以告诉我们没有观察基质金属蛋白酶9的活动。G2肿瘤活性MMP9在场7 ( n = 9 4只)病例和G3 ( n = 11 )。外观的活跃MMP2声称3 G1例( n = 4 ),在所有样本对G2和G3 10例(z 11)。

光密度测量也证实,高分化肿瘤基质金属蛋白酶的活性低于G2和G3 ( P < 0.05 )。MMP2的活性分别是G1: 3。 27 ± 3 。 6 ;G2: 16。 57 ± 13 。 9 ;G3: 13 。 6 ± 12 2 ( P < 0.05 )。MMP9的活动没有为G1报道肿瘤,和其他组,分别G2: 18 ± 13 。 9 ;G3: 38 。 2 ± 22 。 3 。

 4所示。讨论

在胰腺肿瘤我们观察强化免疫细胞浸润。在胰腺癌此前有报道称巨噬细胞参与血管生成( 10),支持肿瘤生长和癌细胞的入侵。他们是血管生成因素的来源也像VEGF和MMP9降解细胞外基质。Tdhe重要的事实是,巨噬细胞可以抑制T细胞的反应。因此,巨噬细胞浸润在创建转移胰腺肿瘤是一个重要因素。我们发现巨噬细胞的数量与淋巴结转移组高。这个观察支持声明对巨噬细胞参与创建转移。

丰富的表达生长因子在胰腺癌组织中是很常见的。当他们参与受体酪氨酸激酶信号通路介导的,他们可能会调节细胞增殖,迁移和生存。先前的研究提供的生长因子表达和有趣的观察。据报道,高水平的EGF和EGFR与淋巴结和远处转移以及减少生存中值( 11]。只有PDGF-BB高水平的血清在预后[有利 12)和高表达在肿瘤与降低胰腺癌生长 13]。在我们的研究中我们观察到一个强大的生长因子的表达;然而,只有c-Met受体我们能够声称G2和G3组之间的统计上的显著差异。没有观察到显著差异与淋巴结转移的关系。

我们的研究结果表明,c-Met在胰腺癌可能是一个关键的元素。这个受体酪氨酸激酶激活HGF和生理上也参与胚胎发育和成年生活中肝再生和伤口愈合 14]。然而其过度胰腺癌中观察到,即使在早期阶段的致癌作用[ 15]。

c-Met激活导致增加增殖,增强的能动性和入侵。因此我们认为增加c-Met G2和G3阶段之间的表达式表示一个更激进的表型可能与epithelial-mesenchymal过渡。EMT通常被认为是转移的第一步,因为它与钙粘蛋白表达减少,出现在N-cadherin [ 16]。

另一个因素是导致淋巴结involvement-presence macrophages-this也证实了我们的研究。我们的研究结果表明,巨噬细胞的数量明显高于与淋巴结转移组中,据报道之前( 17]。最近,它已被证明,巨噬细胞也参与EMT过程( 18]。他们不仅表达EMT-inducing细胞因子也MMP9劈开钙粘蛋白/ β 连环蛋白复杂。棕褐色等人认为,巨噬细胞MMP9也支持EMT的破坏基底膜。这是一个至关重要的入侵癌细胞其他组织的机制。

我们对基质金属蛋白酶的活性的分析表明,MMP2胰腺癌的发展带来更大的影响。可以观察到其活动甚至在肿瘤的早期阶段。相反的活动观察MMP9在G2和G3组。以前曾有报道称,MMP2增加肿瘤细胞的迁移能力( 19MMP2活动)和决心胰液被告知是有用的在诊断胰腺癌( 20.]。MMP9与转移和血管生成 21]。缺乏其活动在G1组触发可能表明它在后续阶段的肿瘤。

 5。结论

在我们的研究表明,在众多影响因素的肿瘤微环境c-Met受体,巨噬细胞浸润و和MMP2产生重大影响胰腺癌的发展和入侵。他们都可能导致EMT我们打算检查在我们的进一步研究。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

要感谢安娜Nasierowska-Guttmejer教授和博士这样Łącka肿瘤的组织病理学评价。本研究进行科学和高等教育拨款的支持。NN404/0693/33。

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