GRP 胃肠病学研究和实践 1687 - 630 x 1687 - 6121 Hindawi出版公司 789363年 10.1155 / 2010/789363 789363年 研究文章 分析 喀斯特外显子2的突变基码12和13的快照相比常见的DNA测序分析 Zinsky 黎加 1 Bolukbas Servet 2 巴奇 Holger 1 Schirren 约阿希姆 2 Fisseler-Eckhoff 安妮特 1 中文版 安东尼 1 研究所病理及细胞学 HSK威斯巴登 美因茨大学的学术医院 威斯巴登Ludwig-Erhard-Strasse 100, 65199 德国 uni-mainz.de 2 美国胸外科 HSK威斯巴登 美因茨大学的学术医院 威斯巴登Ludwig-Erhard-Strasse 100, 65199 德国 uni-mainz.de 2010年 09年 12 2010年 2010年 24 09年 2010年 10 11 2010年 10 11 2010年 2010年 版权©2010黎加Zinsky et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

由于要求快 喀斯特突变状态分析患者的单克隆抗体治疗转移性结直肠癌,敏感,容易经济和可行的方法是必需的。在这方面,快照的敏感性和特异性分析常用的DNA测序相比检查。我们检查了 喀斯特突变的外显子2基码12和13 100年与DNA测序和快照分析formalin-fixed胰腺癌肿瘤石蜡包埋组织样本,结直肠癌,nonsmall细胞肺癌标本的原发肿瘤或转移。这些示例展示了变异的40% 喀斯特使用顺序和SNaPshot-analysis基因;额外的5个样品(45/100)被确定只有快照。 喀斯特突变检测分析方法是可行的和可靠的快照。快照更频繁的突变检测的分析表明,该方法具有很高的检测精度的概率 喀斯特突变而测序。

 1。介绍

结直肠癌,nonsmall细胞性肺癌(NSCLC),胰脏癌的三个最常见的癌症死亡率的原因。

建立疗法是针对表皮生长因子受体(EGFR),如帕尼单抗( 1- - - - - - 4)和西妥昔单抗( 5- - - - - - 8)(两个单克隆抗体)治疗转移性结直肠癌,吉非替尼NSCLC,或者埃罗替尼治疗非小细胞肺癌和胰脏癌。成功使用西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结直肠癌的治疗取决于不变异 喀斯特基因;如果治疗是无效的 喀斯特有任何突变基因( 1, 5, 6, 8),导致一个激活g蛋白即使在没有配体,如表皮生长因子( 9, 10]。这将导致进一步的恶性增殖的细胞,尽管治疗。

两个密码子 喀斯特已知基因主要是产生交替持续激活的蛋白质没有绑定到表皮生长因子受体配体结合的信号。这是密码子12和13的外显子2 喀斯特基因( 9, 10]。这两个密码子编码的氨基酸甘氨酸野生型蛋白。更换前两个基地之一领导在这两个交换的一种氨基酸的密码子喀斯特蛋白质,导致上述治疗的耐药性的肿瘤。

取代甘氨酸会导致电阻的差距,这是导致喀斯特绑定三磷酸鸟苷的水解蛋白质GDP。三磷酸鸟苷水解的差距无法影响KRAS基因突变导致本构活性蛋白( 10]。

到目前为止 喀斯特突变分析主要是由DNA测序( 5)和商业化测试系统通过dna dna杂交(如Chipron,柏林,德国),焦磷酸测序( 11,或Therascreen:从试剂盒(k - ras基因突变工具 12基于实时PCR技术。考虑到一个非齐次基因型有关 喀斯特突变状态的肿瘤细胞,更敏感的检测方法是必需的。如果肿瘤有一个小的内容 喀斯特突变细胞,而不是被DNA测序,anti-EGFR疗法可能失败有一个anti-proliferating影响这些细胞。

快照分析被认为是更可靠的比较常见的DNA测序( 8),能够检测微小等位基因的突变 喀斯特。本研究的目的是测试快照方法相比,DNA测序筛查 喀斯特突变。

 2。材料和方法 2.1。肿瘤组织样本和DNA提取

我们的研究是使用来自不同来源的肿瘤组织样本:正常的非小细胞肺癌病例的诊断 n = 41 ,33岁手术切除标本和8活检标本)和结直肠癌( n = 20. ,18手术切除标本和2活检标本),存档胰脏癌( n = 19 8手术切除标本和11个活检标本),和FFPE (formalin-fixed石蜡包埋)材料的结直肠癌标本幻灯片的多个实验室的比较 喀斯特突变筛查在2008年的春天,德国社会组织的病理变化。所有标本都是匿名的,由一个病理学家检查,选择一个tumor-area DNA-isolation至少70%的肿瘤细胞至关重要。Weichert et al。 13]提到标本港务少于10%的肿瘤细胞表现出较低的突变率不管使用的方法。

肿瘤组织固定在幻灯片(3 μdeparaffinated米厚),组织材料使用QIAamp microdissected进行DNA提取DNA微工具包(试剂盒、希尔登,德国)。从多个实验室的组织材料比较幻灯片被显微镜鉴定肿瘤和正常组织和DNA提取来自两个组织样本( n = 20. )。

 2.2。扩增步骤之前快照和测序分析

后提取的基因组DNA样本, 喀斯特基因外显子2扩大了PCR (HotStarTaq DNA聚合酶、试剂盒、希尔登,德国)以下引物组:5′-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3′, 5′-CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3′( 8]。检查后放大产品在琼脂糖凝胶,PCR反应与MinElute纯化PCR净化设备(试剂盒、希尔登,德国)和用于排序和快照的反应。

每个PCR反应25 μL卷,包含:上述引物浓度为400 nM, MgCl 1×PCR缓冲,2.5毫米2,0.1 μ克/ μL BSA, 5单位的聚合酶,200 μ每个deoxynucleotide M, 100 ng的基因组DNA。PCR反应了以下计划:95°C初始激活HotStarTaq DNA聚合酶的变性15分钟,第二步在94°C变性30秒,第三步退火的引物模板在55°C 30秒,第四步30秒72°C的底漆扩展。重复步骤2到步骤4是45次紧随其后的是最后一个在72°C扩展步骤10分钟,然后PCR反应是冷却到8°C。一个PCR准备用于测序反应和快照的分析。

 2.3。DNA测序

纯化的DNA作为模板用于测序反应与BigDye Terminatorv1.1循环测序工具包(应用生物系统公司,福斯特城,CA)。测序反应进行的3′ 喀斯特引物(5′-CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3′)和下面的程序thermocycler: 1分钟首次变性的DNA在96°C,紧随其后的是25秒周期变性在96°C,引物的退火50°C 5秒,60°C和扩展步骤4分钟。这个程序后,样品被储存在4°C。

毛细管电泳在3130年基因分析仪,并获得electropherogram(图 1 (b))分析了finchTV(美国Geospiza、西雅图、佤邦)软件(应收在线)。

快照的重复分析(一)和DNA测序(b)相同的肿瘤组织样本。密码子的突变12位置2鸟嘌呤腺嘌呤转变绝对是可见的快照的分析。测序分析,adenine-peak很难与背景区分开来。

 2.4。快照

引物用于快照实现了相应的算法Di百花大教堂等。 8:密码子12位置1;5′-AACTTGTGGTAGTTGGAGCT-3′,密码子12位置2;5′-GATCGTACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3′, 13密码子位置1;5′-GATCGATCGATCTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT-3′, 13密码子位置2;5′-GATCGATCGATCGATCGATGTGGTAGTTGGAGCTGGTG-3′。这些引物退火前一个核苷酸位置可能变异基础上模板DNA和聚合过程中快照多路复用设备(美国应用生物系统公司,福斯特城,CA),只有这种核苷酸作为di-deoxy添加核苷酸引物序列。进一步聚合是排除在外,因为缺乏3′羟基组核苷酸脱氧核糖。

快照反应发生在10 μL卷1 μL PCR产品,5 μL快照多元混合大师,和2 μ米每个引物的浓度。变性的thermocycler计划是25周期在96°C 10秒钟,primer-annealing 50°C 5秒,一个扩展一步60°C 30秒然后冷却4°C。快照后反应进行,净化步骤是必要的,以消除interfering-free核苷酸。加1 μL虾碱性磷酸酶(1 U / μL)(内,伊普斯维奇,MA)和孵化为1小时37°C,后跟一个变性步骤15分钟在75°C,清理快照反应对毛细管电泳在3130基因分析仪(应用生物系统公司,福斯特城,CA)。

毛细管电泳内部DNA分级梯,GeneScan-LIZ 120尺寸标准(应用生物系统公司,福斯特城,CA)。没有进一步分析程序是必要的;相关数据可以直接从electropherogram[读取 8(例如,图 1(一))。

 2.5。统计分析

分析快照的敏感性和特异性 喀斯特突变筛查常见的DNA测序相比进行了测试。DNA测序被认为是标准方法的特异性和灵敏度为100%。

 3所示。结果

在45(45%)的100个组织样本,分析 喀斯特密码子的突变12或13岁被发现。40(88.9%)这些突变 喀斯特基因是由DNA测序和快照,发现进一步的五个突变(11.1%)到快照。这个结果的敏感性100%的置信区间为95%(91.2%到100%)和一个特异性的91.7%的置信区间为95%(81.6%到97.2%),分别为。

图 1显示了一个示例突变检测的快照但不进行排序。分析癌症标本解剖在非小细胞肺癌、结直肠癌和胰腺癌癌。对于非小细胞肺癌,我们发现在15/41 (36.6%) 喀斯特突变的癌症组织样本,在6/20 (30%) 喀斯特突变结直肠标本,在14/19(73.7%)胰腺肿瘤样本,并在9/20(45%)的结直肠肿瘤样本的多个实验室的比较。

突变的类型 喀斯特外显子2基码12和13中可以分组转换和颠换。过渡的突变 喀斯特外显子2基码12和13日发生在大多数(71.4%)的胰脏癌。非小细胞肺癌 喀斯特突变主要发生在颠换(78.6%)和 喀斯特大肠癌癌突变是均匀分布的转换和颠换。在非小细胞肺癌样本,G37T、G38A G35T G34T,和G35A发生。结直肠标本显示G34A、G38C G35A, G34T突变。胰脏癌显示三种不同类型的 喀斯特突变:G35A G34C, G35T。的那种 喀斯特组织样本中发现的突变是明确列在图 2总变异数的百分比。

分层的 喀斯特基因型不同的组织标本。这张照片显示的百分比突变类型中找到特定类型的癌症标本。图片下的传说解释所用的颜色不同的基因型。

 4所示。讨论

给定的百分比 喀斯特突变在非小细胞肺癌是21 - 43% ( 4, 14)和33% ( 15]对结直肠癌和胰腺癌癌(75 - 82.4% 15, 16]。 喀斯特突变频率在我们的检查显示,36.6%为非小细胞肺癌和大肠癌为30%。73.7%的突变 喀斯特胰脏癌基因是按照先前描述的数据( 15]。

关于目前的先决条件 喀斯特突变筛查与帕尼单抗、西妥昔单抗治疗之前, 喀斯特是一个强大的分子标记在癌症诊断( 1, 5]。分子癌症诊断的负担更个性化治疗这些患者。这一目标所需的分子筛选肿瘤,它揭示了化疗癌症特征相关的响应。

几项研究表明更大的受益于西妥昔单抗治疗EGFR表达转移性结直肠癌患者 喀斯特野生型( 5- - - - - - 7]。西妥昔单抗的一线治疗结合铂,甲酰四氢叶酸,氟尿嘧啶增加转移性结直肠癌患者的总体响应率( 17]。

旁边的重要预测药物反应对于转移性大肠癌癌, 喀斯特突变也可能是决定性的药物在非小细胞肺癌的决定关于埃罗替尼、吉非替尼,因为这些激酶抑制剂在癌似乎是无效的 喀斯特突变( 12, 16, 17]。埃伯哈德et al。 14]显示短时间发展和生存中值由埃罗替尼及顺铂治疗的患者的突变 喀斯特相比单独接受顺铂的病人。 喀斯特似乎没有一个预测因子( 15)的一项研究中吉非替尼和晚期大肠癌的化疗。

特别是关于领域的扩张 喀斯特突变状态检测,有必要确定等位基因状态在一个可靠的方法。因此,知识的 喀斯特基因突变状态是至关重要的决定之前治疗癌症病人使用EGFR-targeted帕尼单抗和西妥昔单抗治疗。也考虑到巨大的成本和副作用的治疗, 喀斯特基因突变分析是必要的。

喀斯特突变可以在几个方面筛选:DNA测序,商业化测试系统通过DNA DNA杂交和快照分析( 8]。在本文中,我们比较常见的测序分析和快照,这被认为是更可靠的( 8]。我们的研究结果揭示了一个更好的突变检测,显示的统计分析。敏感度达到100%,特异性91.7%,这意味着高概率的快照的准确性。

确保积极的变异的结果,避免假阳性结果,还建议,旁边一个核无酸的控制样本(“治水”) 喀斯特野生型控制,与已知的野生型 喀斯特序列。

快照分析显示几个优点除了增强可靠性。这是更便宜,更快速测序分析(快照11 €和19 €对DNA测序),可以被分析没有额外的软件,除了Genemapper程序(美国应用生物系统公司,福斯特城,CA)。考虑到这些品质,快照可以取代DNA测序分析 喀斯特突变筛查。

从试剂盒(Therascreen: k - ras基因突变工具 12)使用武器技术的结合和Scorpions-primers,因此可以确定的只有1%的突变等位基因突变野生型基因型的背景。但装备只能检测7可能的突变类型 喀斯特基因,但整个12码突变可以发生在12和13。在我们的分析中,我们发现2突变类型,一分之一结直肠癌标本,检测与therascreen工具包为假阴性。

的 喀斯特在颠换和转换突变可以再细分。这两个事件导致氨基酸甘氨酸的交换到另一个氨基酸的蛋白质。过渡是一个更换一个嘌呤碱或一个嘧啶基地转移到另一个,和一个颠换是一个替代从嘌呤基嘧啶基,反之亦然。转换和颠换的发生并不是均匀地分布在这三个不同类型的肿瘤组织。颠换更频繁地出现在非小细胞肺癌和转换更频繁地在胰脏癌。两种突变类型发生结直肠癌的均匀。一个不平等的出现频率突变类型显示不同的条件在这三个种类的肿瘤。过渡,添加或删除一个氨基是必要的。颠换,基地必须被移除,新基地必须被添加。rie等人的过渡 喀斯特基因在肺癌发生更频繁的不吸烟者比前任或现任吸烟者。这可能意味着颠换突变是与吸烟有关 18]。

的协议 喀斯特检测只有快照,它是可行的缩短PCR的纯化步骤,只使用一个SAP /挂式干扰核酸的降解。根据PCR产物的大小,快照是可扩展的新发现的单核苷酸多态性,只需添加一个合适的引物和PCR产物的反应。这是一种更便宜的方法来分析snp在其他基因组区域可以通过添加引物的PCR和快照的反应。然而,数据不能重新被忽视的序列。快照必须重复与额外的引物。

小比例的突变 喀斯特等位基因可以很容易地通过上述方法的筛选。在事件的 喀斯特突变,治疗用单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗应该撤回( 5, 11]。微小等位基因的突变 喀斯特建议大部分野生型细胞有关 喀斯特基因在肿瘤。缺乏量化的 喀斯特突变等位基因可能剥夺病人的治疗,这可能是针对肿瘤细胞与完好无损 喀斯特基因。因此, 喀斯特突变检测与快照可以更加强的作用反应的治疗取决于预测反应可以预计由于突变的数量 喀斯特等位基因的肿瘤。

 利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。

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