这次调查中使用的所有化学品均为分析纯,获得Sigma-Aldrich (Steinheit,德国)。这些包括二甲亚砜(DMSO)、环丙沙星、脱脂奶粉、3 - -2.5 (4.5 -dimethythiazol-2-yl)二苯溴化四唑(MTT),仅有肉汤基础,罗瑞亚琼脂。

金黄色葡萄球菌从微生物部分写明ATCC 9144大学生物科学学院的博茨瓦纳哈博罗内,博茨瓦纳。细菌被保存为甘油股票−35°C。对于每一个试验,细菌生长在一个仅有24 h琼脂在37°C,紧随其后的是接种Luria肉汤。培养液浓度调整到10的浓度⁶出口的。u /毫升使用麦克法兰标准。

C。 citrinus叶子,凭证号码UZ2 E7,收集从哈拉雷(津巴布韦大学:16.8^o年代,31.1167^oE)。叶子样本验证分类学者,克里斯托弗先生Chapano国家植物标本和植物园,哈拉雷,津巴布韦。树叶在运行自来水清洗去除土壤和尘粒和干在烤箱50°C。植物提取物的制备是由第一次磨细粉的叶子用研钵和研杵。大约50 g粉是放置在一个塑料烧杯和50 500毫升:50 (v / v) DCM:甲醇添加到粉。第二个样本准备把粉50克500年50 ml: 50 (v / v)水:乙醇。冷浸渍法提取粉的叶子的植物化学物质。获得的混合物是通过绘画纸1号滤纸过滤,集中在真空中使用一个旋转蒸发器RII (BUCHI、LabortechnikAG、瑞士)。提取干一个恒定的质量在寒冷的空气从风机通风橱内阁。提取都是存储在无菌离心管在−4°C到使用。

最低抑制浓度(麦克风)测定使用(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium MTT试验。试验是一个比色法用于测量甲瓒肝癌和酶的活性降低,给一个紫色的颜色在新陈代谢活跃的细胞( 11]。植物提取物是溶解在DMSO最终浓度为2.5%,在仅有肉汤稀释所需浓度的12.5,25、50、100μg /毫升到96 - microtitre板块。文化的 金黄色葡萄球菌(100 μl)的最终浓度1×10⁶出口的。u / ml被添加到每个。环丙沙星是作为阳性对照,仅有2.5% DMSO肉汤是包括作为一个消极的控制。Microtitre板块在37°孵化24小时在实验室里的同伴孵化器(Jeio科技有限公司,首尔,韩国)在一个封闭的湿润的气氛。细胞的生长是量化使用Genios Pro标(瑞士Tecan集团有限公司Mannedorf)使用光密度的变化在590 nm前后24小时孵化。作为一个指标的增长,25岁 μl 2毫克/毫升MTT被添加到每个microtitre板井和孵化2 h。观察一个紫色的颜色在那里生长的细菌,和一个黄颜色的观察,没有增长。麦克风当时确定的最低浓度没有增长。最低杀菌浓度(MBC)决心从麦克风板。为了确定MBC,样本麦克风microtitre板。铂环量的培养液收集从microtitre井浓度小于或等于麦克风。样本镀上仅有琼脂一式两份,一夜之间,细菌生长后评估孵化24小时37°C。最低浓度的提取没有增长被认为是MBC。

执行的分析是基于Vijayaraghavan报告的方法和文森特( 12与修改)。一卷400毫升的脱脂牛奶琼脂是由溶解肉汁1 g / L,蛋白胨5.0 g / L,氯化钠8.0 g / L,琼脂15 g / L,脱脂奶15 g / L。溴甲酚绿染料的质量0.006克补充道。解决方案是由高压灭菌的无菌Accu消毒器高压釜(VWR科学制品有限公司、美国)。最后一个100的浓度 µg / ml tormentic酸,100 µ克/毫升水:乙醇提取,50 µg / ml DCM:甲醇提取物添加到单独的离心管包含30毫升的媒体。环丙沙星是用作积极控制在25的浓度 µ克/毫升。消极的控制盘,500年 µl (DMSO溶液添加到液体琼脂。琼脂涌入六贴上培养皿,分别可以巩固。 金黄色葡萄球菌细胞被稀释使用Luria汤的浓度为1×10⁸c.f.u /毫升。一卷5 µl细胞被分发到琼脂板上。板块在37°C 48小时孵化。确定蛋白酶活动、菌落直径和菌落周围的带间隙测量。蛋白酶活动(公关)测量菌落的直径比的总直径殖民地+水解区计算如以下方程: (1) 公关 = 菌落直径 菌落直径 + 的水解 。

两个从树叶中提取准备的 C。 citrinus。水:乙醇提取产量的9.4%比例较高的DCM:甲醇提取收益率为1.6%。水的混合溶剂:乙醇具有潜在的提取范围广泛的植物化学物质( 13]。提取的植物化学物质,可以使用该溶剂混合物包括类黄酮、sapononins,苯酚对苯二酚、甾醇类、生物碱。此外,水被称为万能溶剂,因为它溶解各种不同的分子。这是因为水与其他分子形成氢键的能力。水分子有极性排列的原子氧和氢。一方面,氢有正的电荷,和另一方面,氧带有一个负电荷。这允许水分子成为吸引许多其他不同类型的分子( 14]。

提取的影响 c . citrinus和tormentic酸 金黄色葡萄球菌使用汤采用微量分析测定。两种提取物显著抑制增长 金黄色葡萄球菌如图 1。

DCM的抑制百分比:甲醇提取物和水:乙醇提取物为97.1%和97.9%,分别。中等收入国家的两个提取测定。两种提取物 c . citrinus的有力增长抑制剂 金黄色葡萄球菌50的MIC值 µ克/毫升。浓度为100 µg / ml tormentic酸抑制的增长 年代。 葡萄球菌了72.7%。这些发现与之前的研究结果相一致,表明tormentic酸产生抑菌效果对革兰氏阳性细菌( 15]。环丙沙星,积极控制,抑制的增长 金黄色葡萄球菌。0.125环丙沙星的麦克风被发现 µ克/毫升。MBC的提取物是由电镀 金黄色葡萄球菌这是25 µ50 g / ml, µ克/毫升和100 µ克/毫升每个提取Luria琼脂板上。对两种提取物表现出杀菌活动 金黄色葡萄球菌。DCM的MBC:甲醇提取是50 µ克/毫升时,水:乙醇提取是100 µ克/毫升。植物化学物质或中次生代谢产物存在 c . citrinus其中包括萜类化合物和生物碱( 16)可能是负责观察抗菌活性。植物化学物质通过不同的机制发挥他们的抗菌活性。例如,单宁铁剥夺或非特异性相互作用至关重要的蛋白质,如酶( 17]。最有效的抗菌植物化学物质中 c . citrinus树叶已报告是由于存在生物碱和酚类 18]。根据提取物的抗菌活性 c . citrinus和tormentic酸观察到在这项研究中,提取和tormentic酸抑制剂强有力的增长。然而,提取更有效的抑制增长 金黄色葡萄球菌相比之下,tormentic酸。组件的提取物表现出高抗菌活性较孤立的化合物。这可能是因为,在提取大量化合物的构成,因此他们的抗菌活动可能涉及协同交互( 19]。

蛋白酶进行化验,以确定tormentic酸和提取物的效果 c . citrinus在细胞外蛋白酶的生产 金黄色葡萄球菌。Pr值的参考范围改编自Elleboudy et al。 20.)被用来解释蛋白水解活性。公关tormentic酸值计算,提取 C。 citrinus和控制样本如表所示 1。

结果在表 1显示板上没有观察到的蛋白水解活性包含tormentic酸。这表明生产胞外蛋白酶的抑制。Tormentic酸能够抑制细胞外蛋白酶的生产 金黄色葡萄球菌;因此,没有可以消化蛋白酶通过基质营养琼脂。因此,tormentic酸完全抑制细胞外蛋白酶的生产 金黄色葡萄球菌。Tormentic酸是一种三萜,这些组件可以抑制细菌的生长,减少分泌蛋白质等的生产 α毒素,staphyloccoccal肠毒素A, staphyloccoccal肠毒素B [ 21]。由tormentic酸蛋白酶抑制作用的确切机制尚不清楚。三萜烯的计算机建模提出了合适的分子大小适合疏水界面的放松的单体,它抑制蛋白酶二聚作用[ 22]。额外的疏水相互作用,氢键是蛋白酶之间还建议在三萜烯和羟基或羧基组支架( 23]。由于本研究的主要目的是屏幕tormentic酸和提取物的抑制作用 C。 citrinus蛋白酶生产,进一步研究其他抑制机制使用生物分析和计算机模拟需要在未来的研究。弱和温和的蛋白水解活动观察在盘子里面摘录 c . citrinus观察,一个强大的蛋白水解活性的消极的控制面板。产生的胞外蛋白酶的提取量减少 金黄色葡萄球菌。然而,这些殖民地蛋白水解作用的区域相对较小而消极的控制面板上的蛋白水解作用区与细胞。消极的控制面板没有提取,以及强烈的蛋白水解活性观察。这表明, 金黄色葡萄球菌产生的胞外蛋白酶消化底物在营养琼脂导致菌落周围区域的蛋白水解作用。水:乙醇提取、蛋白水解活性从50随着提取物浓度的增加而减少 µ克/毫升到100 µ克/毫升。蛋白酶抑制作用的植物提取物已被归因于抑制细菌蛋白酶参与多种生理过程除了抑制剂和细胞壁之间的相互作用或从质膜蛋白质导致细胞通透性改变,促使细菌的死亡( 24]。琼脂板包含环丙沙星作为积极的控制和显示没有蛋白水解活性 年代。 葡萄球菌。细菌毒力控制和协调的一个细胞间通讯的过程称为群体感应(QS)。等革兰氏阳性细菌 金黄色葡萄球菌使用QS协调的表达生产毒性因素包括胞外蛋白酶的生产。研究表明,一些植物化学物质可以作为群体感应抑制剂( 25]。本研究的结果表明,植物化学物质提取 c . citrinus可能作为抑制剂,以减少细胞外蛋白酶的生产 金黄色葡萄球菌。在100 µg / ml, tormentic酸显示出部分抑制的增长(72.7%) 年代。 葡萄球菌但能完全抑制蛋白酶的细菌的生产。之前的研究表明,许多抗菌化合物表现出小影响整体经济增长的细菌可以极大地影响S的表达式 。葡萄球菌毒力因素( 26]。额外的目标细菌生长,有效的治疗策略也应该采用antipathogenic或antivirulence疗法( 27),目标细胞过程负责发病机理和毒性等细胞外蛋白酶的生产。