JBB 生物医学和生物技术杂志》上 1110 - 7251 1110 - 7243 Hindawi出版公司 104853年 10.1155 / 2009/104853 104853年 研究文章 结合使用一份和PP7外套融合显示TIA-1主导hnRNP A1为K-SAM外显子剪接的控制 Gesnel Marie-Claude 1、2 德尔Gatto-Konczak 的法 1、2 Breathnach 理查德。 1、2 马蒂亚斯 帕特里克 1 由U892 8法国Moncousu 70721年英国石油公司 44007年南特Cedex 1 法国 univ-nantes.fr 2 将des科学 南特大学 44300年南特 法国 univ-nantes.fr 2009年 14 1 2010年 2009年 17 07年 2009年 30. 10 2009年 2009年 版权©2009 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

拼接的FGFR2 K-SAM外显子是压抑和hnRNP A1绑定到外显子的激活TIA-1绑定到下游基因内区。两个蛋白质表达同样的细胞是否将外显子拼接,所以重要的是要知道哪一个是占主导地位。要回答这个问题,我们使用噬菌体PP7和噬菌体一外套融合范围hnRNP A1和TIA-1截然不同的站点在同一pre-mRNA分子。hnRNP A1融合到一个外壳蛋白被拴在K-SAM外显子包含相应的外壳蛋白的结合位点。TIA-1融合其他外壳蛋白是拴在下游基因内区包含外壳蛋白的结合位点。这导致高效K-SAM外显子剪接。我们的结果表明,TIA-1主导K-SAM外显子拼接控制和验证的结合使用PP7和一层蛋白质为研究转录后的事件。

 1。介绍

可变剪接正确的基因表达,控制是至关重要的,重要的是要理解它是如何工作的。我们一直在研究拼接相互排斥人类FGFR2替代外显子K-SAM和BEK 1- - - - - - 4]。的K-SAM外显子拼接在上皮细胞,而BEK外显子拼接在间充质细胞。删除BEK外显子不会导致高效K-SAM外显子剪接的间充质细胞,并删除K-SAM外显子不会导致高效BEK外显子剪接在上皮细胞( 1]。外显子都因此受到至少部分独立拼接控制。我们已经调查了独立拼接控制K-SAM外显子和确定了主要活化剂(TIA-1)和一个重要的抑制因子(hnRNP A1)外显子剪接。TIA-1绑定到一个内含子元素(IAS1)立即下游K-SAM外显子 5 ′ 拼接网站激活拼接的外显子 5]。下游两个内含子剪接增强剂(是)IAS2和IAS3也涉及K-SAM外显子剪接激活( 4]。hnRNP A1绑定到一个外显子剪接消声器(ESS)压制K-SAM外显子剪接( 6]。

TIA-1和hnRNP A1表达上皮和间充质细胞,所以许多不同的模型可以制定K-SAM外显子剪接的控制。举例来说,一个模型假定蛋白质绑定在间充质细胞,hnRNP A1是主导:K-SAM外显子剪接是压抑的。在这个模型中,hnRNP A1在上皮细胞不绑定,所以K-SAM外显子拼接。在另一个可能的模型TIA-1和hnRNP A1绑定到他们的网站在上皮细胞,但TIA-1占主导地位,因此K-SAM外显子剪接是激活的。在第二个模型中,TIA-1不绑定在间充质细胞,但hnRNP A1,所以K-SAM外显子剪接是压抑的。区分这些类型的模型,我们需要知道两种蛋白质之一是占主导地位的,如果是这样,哪一个。简单的hnRNP A1或TIA-1超表达的研究不能令人满意地回答这个问题。任何观察到的效应可能是间接的,包括绑定其他蛋白质的合成是由过度引起的协议。然而被克服这困难可以通过拘束hnRNP A1的外显子和TIA-1基因内区用不同的rna结合域。

以前我们使用噬菌体一外壳蛋白融合范围要么hnRNP A1 ( 6]或TIA-1 [ 7]pre-mRNA分子含有RNA发夹将一件外套。拘束两个蛋白质相同的pre-mRNA分子意味着使用两个融合伙伴不同的RNA结合特异性。外壳蛋白的 铜绿假单胞菌RNA噬菌体PP7绑定到一个不同于一份发夹RNA发夹一凸起腺苷的位置和序列的循环 8]。因此,每个外壳蛋白结合好自己的发夹,但显示了发夹亲和力很少被其他外壳蛋白( 9]。我们调查的使用PP7外套拘束蛋白质,RNA转染细胞的融合。我们表明,PP7外套融合函数相同的方式对应的一层融合,这一份和PP7外套融合种族歧视,他们的同源结合位点。这允许我们使用一份和PP7外套融合将TIA-1和hnRNP A1争夺控制K-SAM外显子剪接,并表明TIA-1是占主导地位的活动。

 2。材料和方法 2.1。微基因

RK97一直在前面描述的( 5]。微基因S3和S4是由替换PstI-XbaI片段RK97包含IAS2(没有可检测293个细胞的活动)和一些侧翼序列(核苷酸80 - 214的基因内区下游K-SAM外显子)和退火寡核苷酸编码,分别为单PP7或一份RNA发夹(序列图所示 1 (b))。S1和S2微基因是由一种RK12 [ 2]删除BEK的外显子,通过替换一个EcoRI-EcoRV从猫外显子片段退火寡核苷酸编码PP7或一份RNA发夹,分别。任何在坐标系的创建终止密码子是可以避免的。微基因S5和S6 S1和S2,分别通过替换包含IAS2 PstI-XbaI片段(见上图)和退火寡核苷酸编码为一份或PP7 RNA发夹,分别。

外套与RNA发夹融合二聚体及其交互。(一)PP7和一份大衣二聚体的示意图表示。二聚体包含一个标记抗原决定基(DYKDDDDK) SV40核本地化序列(NLS) PKKKRKV,和两个PP7 ∆ FG外套单体(PP7大衣)加入到链接器TS(段勇)4IH或两个一份V75E A81G外套单体(一层)与一个丙氨酸残基(Ala)。这里使用向量允许生产的蛋白质与额外的序列(灰色框)国旗标签和外套之间的蛋白质。(b)的示意图表示PP7 (A1-PP或TIA-PP)和一份(A1-MM或TIA-MM)外套融合,及其预测与同源的互动和非同源RNA发夹。P: PP7 ∆ FG外套单体;M:一份V75E A81G外套单体。灰色椭圆:融合的合作伙伴。

 2.2。融合蛋白向量

一份从pCI-MS2外套序列 6)和PP7 ∆ FG外套从罗伯特提供的质粒序列歌手,纽约( 10),是用来让一层二聚体或PP7序列编码 ∆ FG二聚体使用标准技术。二聚体编码序列引入一个向量基于版本的pCI-neo (Promega)删除新霉素抗性基因( 6),所以被置于控制之下的巨细胞病毒即早期启动子和SV40晚聚腺苷酸化的信号。二聚体编码序列是下游一个向量序列编码标记抗原决定基标记分开一个SV40核定位信号的帧polylinker ATGCATACGCGTGATATCCTCGAGTCTAGA NsiI包含网站,MluI, EcoRV XhoI, XbaI。TIA-1和hnRNP A1序列的质粒中描述( 5, 6),分别被用来使向量表达融合蛋白与外套二聚体。在建设这些向量,SV40 NLS被删除,TIA-1和hnRNP A1有自己的NLS序列。结构被测序验证。

 2.3。转染和rt - pcr

5 × 10 5 293 - ebna细胞(英杰公司)是由磷酸钙转染技术如前所述[ 11)共有5 μ 0.5 g:质粒DNA μ 0.02 g微基因, μ g TIA-1-coat融合向量和/或1 μ g hnRNP A1-coat融合向量添加在适当的地方,pEGFP-1 (Clontech)用于使总5 μ g DNA。这些条件选择不同的表达载体/微基因比例后进行初步实验。他们导致显著的变化在拼接cotransfecting微基因与给定融合蛋白的结合位点的外套一部分蛋白质的表达载体,但无显著的变化在拼接小基因使用不包含这样的结合位点。需要大量的hnRNP A1融合蛋白表达载体最有可能是由于hnRNP A1的主要细胞RNA结合蛋白之一。因此只有一个小的一部分hnRNP A1融合蛋白合成都可以绑定到微基因RNA使用外套一半,大多数分子将会使用其功能hnRNP A1半个绑定到细胞RNA。RNA是收获,rt - pcr分析使用引物P1和P2 [ 11]。代谢途径的循环放大被用来保持指数放大范围。产品迁移在2%琼脂糖凝胶,转移到尼龙过滤器(Hybond N +, Amersham生物科学)和杂化32P-labelled C1和C2调查有关。过滤器受到放射自显影法或用于PhosphorImager分析(PhosphorImager 445 si, Amersham生物科学)量化使用Image-Quant软件。

 3所示。结果与讨论 3.1。hnRNP A1和TIA-1融合外套二聚体

我们希望范围只是一份TIA-1或hnRNP pre-mRNA A1。然而,正如一份和PP7外套蛋白结合同源二聚体发夹,两份蛋白质融合将拴在每一层单体RNA发夹。拘束只是一份需要融合蛋白质外衣二聚体。这样的二聚体可以通过连接两个外套蛋白一起短链接器( 12]。外套二聚体之间的相互作用可以避免用一份外套V75E A81G突变( 13],PP7外套为氨基酸67 - 75 (PP7删除 ∆ FG) [ 10]。我们为生产PP7构建表达载体 ∆ FG或一份外套V75E A81G二聚体的n端标记抗原决定基标记和一个SV40核本地化信号(PP和MM,分别地。,图 1(一))。向量包含polylinker插入额外的编码序列的国旗标签和核之间的定位信号,用于制造额外的向量编码hnRNP A1融合(A1-PP和A1-MM)和TIA-1融合(TIA-PP和TIA-MM)。hnRNP A1和TIA-1有自己的核定位信号,SV40核本地化的序列编码信号被逐出hnRNP A1和TIA-1融合向量。预期的RNA结合特异性的蛋白质如图 1 (b)。免疫印迹蛋白质提取物转染293细胞与国旗M2抗体表明,蛋白质合成正确(数据未显示)。

 3.2。拴在hnRNP A1-PP7外套融合压制拼接

我们的第一个目标是测试如果hnRNP A1和TIA-1融合PP7外套复制相应的行为我们已经描述了一份外套融合( 6, 7]。为此,我们一起建造各种包含不同K-SAM-based FGFR2微基因外显子在C1和C2侧面相应外显子和内含子(图 2)。我们先前已经表明,取代大多数K-SAM内部外显子序列(包括ESS)由细菌CAT-encoding序列(突变包括EcoRV和萨利·网站)导致高效K-SAM在间质细胞(微基因外显子剪接RK12 [ 2])。然而,更换一个RK12 EcoRV-SalI猫片段的序列包含K-SAM外显子的ESS收益率的外显子剪接的忠实地再现了K-SAM外显子( 3, 4]。RK12系统从而方便测试不同的序列的能力压制K-SAM外显子剪接。微基因S1和S2是由取代RK12猫外显子的EcoRV-SalI片段PP7或一份发夹,分别允许拘束A1-PP或A1-MM外显子。竞争的小基因也被删除BEK外显子,所以一个简单的rt - pcr协议使用minigene-specific引物P1和P2可以用来衡量包容或跳过K-SAM-derived“猫外显子。”

使用的微基因的结构。RSV:劳斯氏肉瘤病毒长末端重复启动子。使用BGH:牛生长激素聚腺苷酸化的信号。C1和C2:侧向外显子。与其ESS K-SAM的外显子存在于S3和S4。在S1, S2, S5, S6内部K-SAM外显子序列包括ESS已经被细菌氯霉素乙酰tranferase序列(CAT)分裂的插入序列编码单一份或PP7 RNA发夹如图所示。S3-S6序列编码,单一的一份或PP7 RNA发夹已经引入到下游基因内区。IAS1: TIA-1结合位点。微基因的删除BEK外显子( ∆ BEK),但包含K-SAM外显子的是IAS1和IAS3。S1和S2包含IAS2也。的位置minigene-specific用于rt - pcr引物P1和P2。

293个细胞(通常不拼接K-SAM外显子)与S1和S2,转染和RNA是收集和分析通过rt - pcr引物P1和P2。对于这些小基因,猫外显子拼接的效率是毫无防备的外显子的ESS(图 3(一个),通道1和5)。的影响来确定拘束A1-PP或A1-MM, S1和S2是cotransfected这些融合蛋白的表达载体。拼接的S1 CAT-PP7外显子被压抑cotransfecting A1-PP向量(比较巷3巷1和2)在相同的程度上的拼接S2 CAT-MS2外显子被压抑cotransfecting A1-MM向量(比较巷7道5和6)。最重要的是,拼接的S1 CAT-PP7外显子不压抑cotransfecting A1-MM向量(比较巷4车道1和2),也不是S2的拼接CAT-MS2外显子紧cotransfecting A1-PP向量(比较巷8车道5和6)。这些结果表明,镇压不能归咎于一些间接影响hnRNP A1超表达的一部分,但它需要拘束hnRNP A1一半的外显子。此外,结果表明,每个融合歧视支持其同源RNA发夹,而且hnRNP A1-PP7外套融合繁殖的行为对应一份外套融合。

PP7和一层蛋白质融合功能和种族歧视,他们的同源RNA发夹。(一)hnRNP A1外套融合。293个细胞和微基因cotransfected S1和S2作为PP7外套二聚体标记和向量的编码(PP),一份外套二聚体(毫米),hnRNP A1融合PP7外套二聚体(A1-PP),或hnRNP A1融合一外套二聚体(A1-MM)。RNA是收获,受到使用rt - pcr引物P1和P2(图 1)。公司:K-SAM猫或外显子包容。跳过:K-SAM或猫外显子跳过。百分比K-SAM包含表示每个车道是三个独立的转染的平均值 ± 堡。

 3.3。拴在TIA-1-PP7外套融合激活拼接

为了测试系TIA-PP可以激活拼接以及TIA-MM,我们使用微基因S3和S4(图 2)。这些小基因包含IAS1和携带K-SAM外显子与序列编码PP7发夹(S3)或一份发夹(S4)下游基因内区。是什么原因使用这些微基因而不是微基因的IAS1取代了一个发夹吗?事实上,这些后者微基因不是有用的,TIA-1-coat融合蛋白不激活拼接当招募到一个发夹取代IAS1(我们的未发表的结果)。拼接激活,TIA-1绑定到IAS1元素立即下游 5 ′ 拼接网站需要联系snRNP绑定到UI 5 ′ 拼接的网站( 14]。精确定位的TIA-1名RRMs相对 5 ′ 拼接的网站对于这种接触是必要的。这个位置只能通过TIA-1与IAS1交互,所以TIA-1拴在一个发夹取代IAS1不会激活拼接。然而,我们展示了在其他地方,拘束TIA-1-MS2外套融合内含子站点下游IAS1激活K-SAM外显子剪接在293个细胞 7]。激活是严格IAS1-dependent,这意味着拘束增加TIA-1 IAS1周围的局部浓度,并允许拴在TIA-1 IAS1绑定,从而与U1 snRNP激活拼接。

293个细胞与S3和S4 cotransfected和RNA提取和分析。对于这些小基因,K-SAM外显子拼接效率(图 3 (b),通道1和6),因为它包含一个功能ESS。确定的影响拘束TIA-PP或TIA-MM S3和S4 cotransfected这些融合蛋白的表达载体。拼接的K-SAM外显子与一个intronic PP7发夹(S3)是激活cotransfecting TIA-PP向量(比较巷3巷1和2)和拼接K-SAM外显子与一个intronic一发夹(S4)激活cotransfecting TIA-MM向量(比较巷8车道6和7)。

在表达载体的用量在这些实验中,TIA-MM和TIA-PP略微增加的拼接K-SAM外显子与PP7 (S3)和一份发夹(S4),分别在拘束(图是不可能的 3 (b),车道5和10)。我们不认为这反映了低级绑定融合到他们的非同源发夹,而是低级绑定的TIA-1根IAS1 TIA-1浓度的增加导致了TIA-1转染的融合。因此,我们展示了在其他地方TIA-1浓度增加转染诱导相关的K-SAM外显子剪接IAS1 ( 5]:S3和S4 K-SAM外显子与IAS1(图 2)。此外,我们的研究结果与hnRNP A1融合(见上图)提供任何证据支持绑定到非同源发夹。

 3.4。拴在TIA-1主导拴在hnRNP A1

拴在hnRNP A1压制K-SAM外显子剪接,拴在TIA-1激活K-SAM外显子剪接。同时如果hnRNP A1和TIA-1拴在吗?微基因S5和S6设计约束hnRNP A1融合猫外显子,和TIA-1融合到下游内含子序列(图 2)。这些小基因不包含的ESS猫外显子,所以他们的猫外显子拼接效率在293细胞(图 4,通道1和6)。正如所料,绑A1-PP S5 CAT-PP7外显子能显著降低其拼接(比较巷3巷1和2)。

TIA-1统治hnRNP A1。293个细胞和微基因cotransfected S1, S2, S5,或S6标记和向量编码PP7外套二聚体(PP),一份外套二聚体(毫米),TIA-1融合PP7外套二聚体(TIA-PP),或TIA-1融合一外套二聚体(TIA-MM)。RNA分析中描述的传奇人物 3。

镇压被拴在A1-PP几乎完全废除的额外cotransfection TIA-MM(比较巷4车道2和3)。这种废除需要拘束TIA-MM的基因内区,作为cotransfection TIA-MM并不废除拼接拴在A1-PP镇压的实验与S1微基因,其中包含一个A1-PP但不是TIA-MM结合位点(巷5)。因此,我们可以排除任何解释基于TIA-MM表达减少拼接A1-PP水平太低的镇压。

这些结果可以复制如果PP7和家里打电话闲聊一发夹(微基因S6,图吗 4)?拘束的影响未溶化的MM或PP猫外显子是一般小(S1, S2微基因和S5,数字 3(一个)和 4)。拘束MM S6 CAT-MS2外显子剪接有较大影响(从98%减少到58%,比较6巷巷7),我们可以提供任何解释。然而,获得更大的减少拼接如果A1-MM系(从98%提高到13%,比较巷8车道6和7)。重要的是要区分这部分减少(从98%到58%),可以归因于A1-MM拘束的MM一半,和部分(从58%到13%),可以归因于A1一半的拘束。减少拼接的拴在A1一部分归因于A1-MM几乎完全消除如果TIA-PP cotransfected:拼接的水平从13%恢复到49%。这是观察到接近(58%)当拘束毫米(比较巷9巷7)。请注意,我们不能指望拼接恢复到98%的水平。没有理由拴在TIA-1能够消除A1-MM施加的压迫的MM一半。

拼接的废除压迫的A1一半拴在A1-MM需要拘束TIA-PP基因内区,作为cotransfection TIA-PP并不废除拼接镇压与S2微基因实验,其中包含一个A1-MM但不是TIA-PP结合位点(巷10)。我们因此可以排除任何解释基于TIA-MM表达减少A1-PP为拼接镇压水平太低了。

 4所示。结论

我们得出这样的结论:当TIA-1 hnRNP A1可以绑定和争夺控制K-SAM外显子剪接,TIA-1是占主导地位的活动。通常,TIA-1绑定刚从外显子的次优的下游 5 ′ 拼接网站帮助招募U1 snRNP拼接网站( 14]。如果TIA-1占主导地位,受hnRNP A1不应该压抑的一个外显子剪接 5 ′ 拼接网站已经被变异呈现最佳。确实是这种情况:A1-PP不再压制拼接CAT-PP7 S1微基因的外显子如果外显子的 5 ′ 拼接网站优化(数据没有显示)。我们建议以下模型K-SAM外显子剪接。在上皮细胞,TIA-1结合IAS1并防止hnRNP A1压抑K-SAM外显子拼接,通过克服的影响ESS-bound hnRNP A1,或防止hnRNP A1 K-SAM ESS绑定。的K-SAM外显子拼接。间充质细胞,hnRNP A1结合ESS,但IAS1 TIA-1不绑定。K-SAM外显子剪接是压抑的。为什么TIA-1绑定到IAS1间充质细胞在上皮细胞而不是?拼接的K-SAM外显子在上皮细胞被激活两个内含子剪接增强剂(IAS 2一3)除了IAS1 [ 4]。这些增强剂招募蛋白质可能至少部分通过拘束TIA-1接近IAS1,从而有利于IAS1绑定。

最后,我们注意到方法涉及拘束一外套融合或混合噬菌体λN蛋白的RNA分子中受益的研究转录后的事件不仅包括拼接也聚腺苷酸化、翻译、RNA RNA本地化和稳定性( 15- - - - - - 23]。这些事件通常涉及一些RNA结合蛋白。我们在这里描述的方法涉及使用PP7和一份融合一般利益,因此应如果扩展到包括N蛋白融合,应该允许拘束的三种不同蛋白质的RNA分子。

 确认

作者感谢罗伯特歌手,纽约的礼物包含PP7质粒 ∆ FG序列。Ligue反对这项工作得到了癌症,部德卢瓦尔河“大西洋和杜Finistere。”

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