1。介绍
肾素-血管紧张素系统(RAS)是维持体内平衡的关键的心血管系统
1 ]。在古典RAS轴,肾脏的肾小球旁细胞释放肾素催化血管紧张肽原乳沟形成糖肽血管紧张素I .血管紧张素I转换为血管紧张素ⅱ的血管紧张素转换酶(ACE)删除两个终端肽血管紧张素I .血管紧张素ⅱ(Ang II)是主要的肽形成在这个古典RAS轴和结合血管紧张素1型受体(AT1R)和血管紧张素2型受体(AT2R) [
2 ]。
Angⅱ的绑定AT1R会造成不利影响,如血管收缩和血管平滑肌的增殖和内皮功能障碍。例如,绑定和二世AT1R损害血管内皮功能通过增加NAD (P) H氧化酶活动和生产超氧化物阴离子(
3 ]。总的来说,这些过程有助于心血管疾病的发展。
之一AT1Rs是经典G-protein-coupled受体和发挥他们的信号通过g蛋白依赖和独立的途径。AT1R-biased配体同时竞争对抗Ang II-stimulated蛋白信号而刺激
β -arrestin通路(
4 ]。这种方法已被证明阻止Ang二世的不利影响,如血管收缩和心脏肥大,而提高有益的对心肌收缩性的影响,和激活凋亡通路。尽管AT1R-biased配体已经在临床试验中测试,证明行动的机制只有在心脏和肾脏组织
5 - - - - - -
8 ]。维管组织的直接影响从未被研究过。
有很多研究使用不同协议的血管反应性和二世(
9 - - - - - -
12 ]。绝大多数研究发现文献中只有间接调查Angⅱ进行血管反应性的作用曲线AT1R的封锁下(
13 ,
14 ]。然而,这些研究被证明产生很多变化的结果。的重要性,研究血管活性肽的RAS也解决了劳特纳等人描述技术和陷阱的使用血管紧张素-(1 - 7)标准协议和1 - 7 (
15 ]。
因为困难的标准化和各种现有的血管紧张素ⅱ血管收缩协议,本研究的目的是规范理想条件和二世在主动脉血管反应性环使用时间,基线紧张,和血管紧张素浓度参数。此外,我们测试了TRV023在主动脉环的影响,肽与偏见AT1受体激动剂活性。TRV023激活
β -arrestin通路的蛋白,它被用于这项研究来验证
β -arrestin血管的影响
在体外 。
2。材料和方法
2.1。动物
Twelve-week-old雄性Wistar鼠(
鼠形阿尔昆 )从圣埃斯皮里图联邦大学的中央动物设施,巴西。老鼠在五组在塑料笼子控制温度(22日至23日°C),光暗周期12:12 h,免费的食物和水。总共32个动物。使用的所有协议和手术是按照巴西大学动物实验的指导方针,并经伦理委员会批准的圣埃斯皮里图联邦大学(CEUA-UFES、协议011/2014)。
2.2。血管反应性实验
如前所述的血管反应性实验(
16 - - - - - -
18 ]。老鼠被斩首安乐死后服用了过量的硫喷妥钠(Cristalia,圣保罗,巴西,200毫克/公斤,i.p),仔细分析了胸主动脉和清洗的脂肪和结缔组织。为反应性实验,主动脉分为圆柱段2毫米的长度。探讨血管紧张素ⅱ的作用在平滑肌层,所有戒指了内皮的机械摩擦腔针。
的胸主动脉是安装在一个器官浴Krebs-Henseleit解决方案(4.7 118年在mM:氯化钠,氯化钾,NaHCO3 23日,CaCl2 2 h2 2.5 O, KH2 阿宝4 1.2,MgSO4 7小时2 1.2 O,葡萄糖11日和EDTA 0.01)的温度37°C O加油为95%2 和5%的公司2 (pH值7.4)和基线张力保持恒定(1 g, 2 g、3 g)。等长张力记录使用等距测力传感器(TSD125C、钙、美国)连接到一个采集系统(MP100, BIOPAC系统,Inc .)、圣芭芭拉分校,美国)和连接到一台电脑。主动脉环都暴露了两次75毫米氯化钾(30分钟),检查船的功能完整性,以及开发的最大张力。内皮删除被乙酰胆碱无法证实诱导前收缩放松大于10%去氧肾上腺素(法)。肌肉层完整性确认如果主动脉环合同至少2 g氯化钾时应用。
2.3。累计(CCEC)血管紧张素ⅱ浓度效应曲线
研究最优间隔时间执行CCEC血管紧张素ⅱ,主动脉环受到Angⅱ(1纳米10毫米),15日,30日,60岁,120秒每个浓度应用程序之间的时间间隔。
2.4。NonnCumulative (NCCEC)血管紧张素ⅱ浓度效应曲线
主动脉瓣收缩和二世与单个受体激动剂的浓度进行分离主动脉环。平衡一段时间后,每个主动脉环被暴露在一个集中的Angⅱ(1纳米到10毫米)。最大收缩被认为是当一个高原了,和紧张开始回到基线。
2.5。确定最佳的静息张力
研究最优静息张力进行血管反应性实验和二世,主动脉环平衡45分钟段1 g, 2 g、3 g的静息张力。后来,主动脉环受到CCEC Angⅱ。
2.6。评价重复性CCEC与NCCEC血管紧张素ⅱ
研究的可能性,使用相同的主动脉血管反应性组织两次实验,后添加了受体激动剂的浓度和获得的效果,组织多次冲洗,直到回到基线,让另一个60分钟平衡期,直到执行另一个实验中(CCEC或NCCEC)。
3所示。免疫印迹
主动脉瓣环与血管紧张素ⅱ或刺激TRV023 10分钟然后在缓冲区里帕均质(50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.4),液0.5%诺乃清洁剂p 40, 0.2%钠脱氧胆酸盐,100毫米氯化钠,EGTA 1毫米,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1
μ g / ml抑肽酶,1毫米原钒酸钠,氟化钠)和1毫米。不溶性组织在3000年被离心×g和4°C 10分钟。样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶(15%)和sds - page。电泳后,蛋白质被electrotransferred硝化纤维素膜(美国BioRad生物科学)。膜被孵化阻断缓冲区(5% BSA, 10毫米Tris-HCl (pH值7.6),150毫米氯化钠,和0.1%渐变20)在室温下2 h,然后孵化一夜之间在4°C和兔子anti-MLC anti-p-MLC抗体。绑定的主要抗体检测到使用特定peroxidase-conjugated二级抗体,并增强化学发光试剂(美国新泽西州Amersham生物科学)被用来可视化使用ChemiDoc™XRS成像系统和软件(美国生物科学Bio-Rad)。乐队强度使用接穗的墨迹图分析了图像软件(Scion公司)。
3.1。统计分析
值表示为均值±SEM。收缩引起的收缩反应表示为% 75毫米氯化钾在同一个主动脉环。变量的高斯分布以前使用正常D 'Agostino-Pearson综合测试分析。合适的量效曲线构造和分析使用非线性回归分析。统计比较不同组由一个或双向方差分析(方差分析),其次是Bonferroni事后考验。差异意味着价值的
p
<
0.05
被认为是统计学意义(统计软件:Prism 7.0, GraphPad软件Inc .)。
4所示。结果
4.1。CCEC改变血管紧张素ⅱ浓度之间的间隔时间
我们第一次评估最优CCEC血管紧张素ⅱ浓度之间的间隔时间。间隔15、30、60和120秒每个血管紧张素ⅱ浓度之间的应用。图
1 总结主动脉环的收缩反应Angⅱ诱导每个时间间隔。60秒的间隔表现出增强的收缩反应相比与其他间隔的两个主要药效学参数的量效曲线。应用浓度每60秒达到最高征求(15秒,44±5%;30秒,38±3%;60秒,54±3%;120秒,3±1%,图
1 )以及最高的灵敏度(压电陶瓷50 :15秒,5.6±0.2米;30秒,5.8±0.1米;60秒,6.6±0.1米;120秒,没有;−日志M和II)。响应Angⅱ应用时没有被观察到有120秒的时间间隔。
图1
累积浓度效应曲线(CCEC)与不同的血管紧张素ⅱ应用程序之间的时间间隔。数据表示为均值±SEM最大的氯化钾收缩引起的。
∗
p
<
0.05
与30秒和15秒;
#
p
<
0.05
与120秒。
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4.2。NCCEC与CCEC Angⅱ
最大响应获得CCEC与NCCEC协议也相比。图
2 显示了这两种方法之间没有差异最大响应(vs NCCEC CCEC, 56±3%, 60.0±3%的氯化钾收缩)。然而,更高的收缩是NCCEC协议在较小的浓度(10−8 M: CCEC, 0±3% vs NCCEC, 21±8%;10点−7 M: CCEC 12±2% vs NCCEC, 39±6%,
p
<
0.05
)。
图2
插值的累积(CCEC)和非累积的量效曲线(NCCEC)血管紧张素ⅱ(Angⅱ)。数据表示为±SEM。
∗
p
<
0.05
与CCEC。
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4.3。重复的血管反应性的影响实验
我们也评估执行可行的可能性第二CCEC或第二个NCCEC Angⅱ使用相同的主动脉环(CCEC二世和NCCEC II)。因为没有观察收缩CCEC我在120秒的时间间隔(图
1 此时间间隔),CCEC II为没有执行。数据
3(一个) - - - - - -
3 (c) 总结的结果和II-induced主动脉环的收缩CCEC我和CCEC II。主动脉环CCEC二世表现出最大收缩反应和II相比CCEC。数据显示明显降低
R 马克斯 (15秒,−51%;30秒,−57%;60秒,−74%)。图
3 (d) 显示了NCCEC I和II的结果。似乎有一个较低的障碍在CCEC NCCEC协议和协议。只有降低17%的最大收缩反应NCCEC我与NCCEC II。最后,证明该模式的响应是特定于盎II,血管反应性还与肾上腺素能执行
α 1 -苯肾上腺素,结果显示没有障碍CCEC II和CCEC我(图
3 (e) )。
图3
尝试使用相同的主动脉组织两个实验。(一)CCEC我和CCEC II 15秒每个血管紧张素ⅱ应用程序之间的间隔,(b) CCEC我用30秒的时间间隔和CCEC II, (c) CCEC我和60秒的间隔和CCEC II, (d) NCCEC我和NCCEC II Angⅱ,我和CCEC II (e) CCEC苯肾上腺素。对于所有的情况下,第二个实验进行60分钟后第一个实验与每个组织。数据表示为±SEM。
(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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4.4。静息张力的影响
我们还测试了静息张力的影响血管反应和二世。图
4(一) 比较不同的紧张局势。在2 g的响应(
R 马克斯 :69.7±4%;压电陶瓷50 :6.92±0.13 -logm)主动脉瓣环的静息张力并修改灵敏度和最大响应Angⅱ相比,1 g (
R 马克斯 :64.9±5%;压电陶瓷50 :6.45±0.07−logM)和3 g (
R 马克斯 :64.8±4%;压电陶瓷50 :6.86±0.08−logM)。
图4
累积量效曲线在不同的静息张力(a)血管紧张素ⅱ(Angⅱ)和(b)去甲肾上腺素(法)。数据表示为±SEM。
∗
p
<
0.05
与1 g和3 g。
(一)
![]()
(b)
![]()
证明这个响应是特定于盎II, CCEC苯肾上腺素也执行1 g的静息张力,2 g和3 g,没有观察到的最大响应差异或使用不同的休息紧张(图对去甲肾上腺素的敏感性
4 (b) )。这些数据表明,静息张力大大有助于血管反应和二世。
4.5。的角色AT1 <斜体>β< /斜体> -Arrestin-Biased信号
接下来,我们测试的激活
β 通过AT1R -arrestin会导致血管收缩。两个CCEC(图
5(一个) )以及NCCEC协议进行(图
5(一个) TRV023)和显示无显著收缩。这些数据表明Ang II-induced蛋白依赖性,血管收缩
β -arrestin独立。
图5
TRV023血管反应性。(一)累积(CCEC)和(b)非累积的量效曲线(NCCEC) TRV023(和)。数据表示为±SEM,
n 为每个条件= 5。
(一)
![]()
(b)
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进一步开发利用
β -arrestin独立通路Ang II-induced血管收缩,肌球蛋白轻链磷酸化(多层陶瓷)也是图分析
6 只显示Angⅱ,但不是TRV023,诱发p-MLC磷酸化在主动脉环。
图6
免疫印迹蛋白质的提取与血管紧张素ⅱ(1主动脉环刺激
µ 米)或TRV023 (1
µ 米)的肌球蛋白轻链磷酸化endothelium-denuded主动脉环。免疫印迹和p-MLC /总代表多层陶瓷比率。数据表示为±SEM。
n = 4。
∗
p
<
0.05
。
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5。讨论
在这里,我们研究了几个参数的血管反应性测定。我们已经观察到60秒是最佳的每个血管紧张素ⅱ浓度之间的间隔时间。我们也观察到,2 g是最好的静息张力和执行2血管反应性曲线并不可行。最后,我们注意到,与血管紧张素ⅱ浓度NCCEC建立曲线也是可能的,不干涉征求或压电陶瓷50 。
首先,我们使用累积量效曲线显示,血管收缩,血管紧张素ⅱ在大鼠主动脉环之间的时间每个应用程序的药物并观察Angⅱ效果理想,大约60秒之间和第二应用程序。短时间(15或30年代)无法产生整体收缩,所表示的降低pD2和低表达的能力
R 马克斯 。另一方面,曲线与每个Angⅱ之间长期应用程序没有显示收缩,即使在低浓度和二世。这可能是由于AT1R的脱敏,表明血管收缩,血管紧张素ⅱ之间更多的取决于时间和II浓度比Angⅱ的浓度。
接下来,我们表明,非累积的Ang II曲线发展更多的收缩力比累积曲线在低浓度。我们还展示了在我们的研究中,无论单浓度或累积量效实验执行,血管对血管紧张素的反应较低在第二个实验中,但是这种损伤在单一浓度相比,浓度低得多的反应证明单一浓度可能是最表示必要时执行两条曲线在相同的戒指。林德等人表明,这在CCEC II发生钝化效果由于Ang II-induced tachyphylactic主动脉环的收缩反应(
12 ]。
它已经出版了我们的团队
19 ,
20. )和其他(
21 - - - - - -
24 ]mechanosensitive AT1R在心血管系统的属性。在这项研究中,我们发现
体外 的主动脉环Angⅱ的血管反应性变化。基底压力的2 g有更高的EC50以及征求相比,1 g的基底压力。2010年,刘等人。
25 ]表明,机械拉伸强化Ang II-induced平滑肌细胞的增殖
在体外 。2014年,唐et al。
26 ]显示AT1R信号的变构调节膜拉伸。他们显示不同的激活ERK1/2 Angⅱ根据提交的细胞的伸展,表明高敏感Angⅱ作为初始细胞伸展。2016年,亚伯拉罕et al。
27 )发现,老鼠缺乏AT1R无法产生一个Frank-Starling力量应对心脏体积的变化,这表明,AT1R信号通路转导的心至关重要。但是,我们是第一个显示功能血管系统AT1R的机械性能。这可能是重要的在疾病条件如高血压或中风RAS阻滞剂可能作用即使没有显著增加的浓度和二世(
28 ,
29日 ]。
除了血管反应性协议的标准化和二世,我们也旨在研究AT1R的偏置配体的影响(TRV023)诱导血管收缩,类似于盎II。我们和其他人已经研究了它对肾的影响(
7 )和心脏系统(
5 - - - - - -
8 ];然而,这是第一次研究显示其在脉管系统的直接影响。我们已经表明,尽管TRV023也结合AT1R,它并没有引起血管收缩和磷酸化MLC2,证明Ang II是g蛋白介导的血管收缩剂的效果。我们没有观察到直接vasodilatatory TRV023的影响,但是我们使用endothelium-free主动脉和船不是preconstricted。未来的研究应该执行这些的存在血管内皮和preconstricted来解决这些问题。TRV027(和TRV023)是一种“偏见”AT1R的配体,有选择地得罪血管紧张素ⅱ的负面影响,同时保留潜在procontractility AT1R刺激的影响。经过几次积极的结果在细胞和动物模型中,研究者开始BLAST-AHF(血管紧张素受体研究的偏置配体在急性心力衰竭),设计确定安全、功效,最优浓度TRV027推进未来的研究。然而,在621名病人,这IIb阶段dose-ranging研究没有改善临床状况后30天随访(
8 ,
30. ]。在这里,我们表明,AT1R的血管收缩剂效应蛋白的依赖,更重要的是,和没有血管收缩的影响。